鲢鱼肌肉脯氨酰内肽酶及抑制肽的研究

发布时间：2020-05-28 01:47

【摘要】：鱼体肌肉生理变化过程与多种内源性蛋白酶密切相关。脯氨酰内肽酶(Prolyl endopeptidase,PEP),属于丝氨酸羧肽酶S9家族,是一类能特异性水解低分子质量多肽链(33个氨基酸)羧基端脯氨酸残基(Pro)的细胞内蛋白酶。本论文以鲢鱼为研究对象,对其内源性蛋白酶PEP进行分析。采用硫酸铵分级沉淀,Q-Sepharose、Sephacryl S-200、Phenyl-Sepharose和Hydroxyapatite连续柱层析的方法对目标蛋白酶进行分离纯化。SDS-PAGE结果显示,该酶的分子量约为80 kDa。Native-PAGE结果表明,该酶有两种不同亚型。Western blotting显示,该酶与兔抗罗非鱼PEP多克隆抗体呈阳性反应。肽指纹质谱鉴定得到13个有效肽段,与斑马鱼、金线渻的PEP序列匹配度分别达100%、98%,确定该蛋白为鲢鱼PEP。圆二色光谱分析显示,鲢鱼PEP二级结构无规卷曲(32.2%)占比最多,β-折叠(27.4%)和α-螺旋(22.4%)次之,β-转角(18.2%)占比最少。酶学性质分析表明:PEP的最适温度为35°C,最适pH为6.0。PEP特异性水解荧光底物羧基端的Pro残基。金属离子Cu~(2+)、Zn~(2+)、Al~(3+)及其特异性抑制剂SUAM-14746均对PEP表现出抑制作用。其中,SUAM-14746对PEP的抑制属于竞争性的可逆抑制,抑制活性(IC_(50))为0.67μmol/L。PEP的酶动力学参数,米氏常数K_m为3.54μmol/L,催化常数k_(cat)为16.9/s。PEP在鱼的脑、心、肝、肌肉、肠、脾、鳃中均有分布,脑组织中PEP表达量最高,心组织中次之,其他组织中表达量相当。在哺乳动物中,PEP通过水解蛋白肽参与机体新陈代谢。研究发现,多种神经退行性疾病患者体内PEP活性显著增加,PEP成为多种疾病治疗的新靶点。海洋红藻紫菜富含蛋白质,其中的藻红蛋白(R-phycoerythrin,R-PE)具有多种功能。坛紫菜模拟胃肠液消化产物具有PEP抑制活性。本研究以坛紫菜为原料,通过硫酸铵盐析和DEAE-Sepharose阴离子交换柱层析等方法分离纯化得到一种高纯度R-PE(A_(565)/A_(280)=5.4)。参考人体对食物的消化模式,对纯化R-PE进行酶解以制备PEP抑制肽。经试验优化,酶解条件为:(1)胃蛋白酶与R-PE比例为0.5%(w/w),酶解时间30 min,pH 1.2,温度37°C;(2)胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶质量比为1∶1的混合酶与R-PE比例为0.25%(w/w),酶解时间30 min,pH 7.5,温度37°C。R-PE水解液用Superdex~(TM) peptide 10/300 GL凝胶柱和ZORBAX Eclipse Plus C18反相柱连续分离,收获单一活性组分。将该组分进行肽指纹质谱鉴定,得到六个肽段与藻红蛋白β链序列的匹配度达100%。选取十一肽MICENPGLIAP并预测其经胃蛋白酶和胰腺酶水解后的消化特性,得到两个三肽:PGL和IAP。通过分子对接模拟分析显示,PGL对PEP表现出非竞争性抑制,IAP对PEP表现出竞争性抑制。体外活性验证结果显示,IAP对PEP(哺乳动物)的抑制活性(IC_(50))为1.49 mmol/L。本论文较为详细地研究了淡水鲢鱼PEP的酶学性质,为探究PEP在鱼机体中的生理功能提供理论基础。利用食源性蛋白质R-PE酶法制备PEP抑制肽的研究,为生物活性肽的制备提供技术支持和理论参考。
【学位授予单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS254.1

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