不同来源葡甘露聚糖的结构特征、溶液性质及在小鼠肠道中的酵解特征

发布时间：2020-05-31 22:05

【摘要】：葡甘露聚糖(Glucomannans,GMs)是一类结构相对简单而分布非常广泛的多糖类化合物,魔芋、芦荟和铁皮石斛是其重要来源。诸多研究发现上述三种不同植物来源的GMs虽属同一结构类型,但是在结构特征方面却存在较大的差异。基于本实验室前期对铁皮石斛和芦荟凝胶GMs的研究,本论文主要分析了魔芋和芦荟GMs的结构特征。然后测定了魔芋、芦荟和铁皮石斛GMs的溶液性质、固体形貌、部分理化性质和肠道酵解特征。主要研究内容和结果如下:(1)制备了四种魔芋多糖并进行了结构分析。采用水提醇沉、酶法除杂、酸性乙醇沉淀、冷冻干燥等工艺获得四种不同魔芋来源的多糖组分,依次命名为KGM(来源于花魔芋)、AGM(来源于白魔芋)、MGM和BGM(来源于两种野生型珠芽魔芋)。四种魔芋多糖含有约90%中性糖、11%水分和1%~2%灰分,不含糖醛酸和蛋白质,乙酰基取代度为0.78~1.25。四种魔芋多糖主要含甘露糖和葡萄糖,两者比值(M/G)依次为1.41(KGM)、1.41(AGM)、1.21(MGM)和1.58(BGM)。四种魔芋多糖的相对分子质量大小顺序为:KGMAGMMGMBGM。结构分析表明它们是一类乙酰化β-(1→4)-葡甘露聚糖,在甘露糖残基的O-2,6位或者葡萄糖残基的O-3,6位存在少量支链。乙酰基取代位点主要在甘露糖残基的O-2和O-3位。(2)分离获得了三个芦荟鲜叶表皮多糖组分并鉴定了结构。采用水提醇沉法结合硫酸铵分级沉淀法,从库拉索芦荟鲜叶表皮中获得ASP-4N、ASP-6N和ASP-8N三个多糖组分。化学组成分析表明三个多糖样品由74%~79%的中性糖、少量糖醛酸与蛋白质组成。高效凝胶渗透色谱测定结果表明三者分子量分布均一,它们的相对分子质量依次为339、130和67.6 kDa。离子色谱数据显示它们主要由甘露糖和葡萄糖组成,M/G值依次为19.13、8.97和2.96。甲基化与核磁结果表明三个多糖组分均为高度乙酰化的线性β-(1→4)-葡甘露聚糖,主链上同时混有少量β-(1→3)-连接的甘露糖残基。核磁数据也表明三个组分的乙酰基主要分布在主链β-(1→4)-甘露糖残基的O-2、O-3和(或)O-6位,并且存在单取代、双取代和三取代等多种取代形式。(3)解析了芦荟鲜叶凝胶多糖的精细结构特征。对芦荟鲜叶凝胶多糖(AGP_(40))进行逐级酸水解和甘露聚糖酶水解,得到酸水解样品(PAH-1、PAH-2和PAH-3)和酶解样品(AGP_(40)-EH)。甲基化和核磁技术分析AGP_(40)及其水解样的糖苷键类型的结果证实,AGP_(40)是高度乙酰化的线性β-(1→4)-葡甘露聚糖,有少量支链分布在主链β-(1→4)-甘露糖残基的O-6位。在主链上还混有少量β-(1→3)-甘露糖残基和β-(1→4)-葡萄糖残基。与芦荟表皮多糖类似,乙酰基以多种取代形式分布在β-(1→4)-甘露糖残基的O-2、O-3和(或)O-6位。(4)测定了四种魔芋GMs的溶液性质、流变性质和微观结构。采用乌氏黏度计测定魔芋GMs的特性黏度,高效尺寸排阻色谱法结合光散射技术(HPSEC-MALLS)测定它们的重均分子质量、均方根旋转半径和流体力学半径等构象参数。结果发现四种魔芋GMs特性黏度的大小与它们的分子质量成正比。HPSEC数据分析表明四种魔芋多糖在0.1 M硝酸钠溶液中表现为无规卷曲构象,同时存在少部分聚集体。经Random flight模型和蠕虫状链模型拟合,计算出它们的持续链长分别为5~8 nm和8~10 nm。流变数据表明四种魔芋多糖均表现出假塑性流体。在动态振荡测试条件下,MGM和BGM的储能模量与损耗模量随频率变化的曲线存在明显的交点(交点的频率分别为3.2和2.0 Hz)。四种魔芋多糖以线状、球体和片状等状态存在。(5)分析了铁皮石斛多糖与芦荟多糖的溶液性质和固体形貌。乌氏黏度计与HPSEC测定结果表明芦荟多糖的特性黏度也与分子质量呈明显的正相关关系,即分子质量越大对应的特性黏度越大。然而,铁皮石斛多糖DOP的特性黏度不遵循上述规律,说明GMs的特性黏度可能不止与分子质量相关,也受乙酰基取代度和单糖组成等其他结构因子的影响。HPSEC-MALLS数据分析发现四种芦荟多糖和DOP主要为无规卷曲构象,它们的分子多为柔顺链。电镜下观察到几种GMs的分子呈现粗细不一的纤维状和大小不一的不规则球体等多种形态。(6)对KGM、DOP和四种芦荟多糖的化学组成和结构信息进行了归纳总结。六种GMs的结构区别主要反映在单糖组成、分子质量和乙酰基取代度三个方面。对六个多糖组分的吸水能力、溶解性、脂肪吸收能力、ζ-电位和表观黏度进行了测定与比较,结果显示分子质量与吸水能力、溶解性和黏度具有较大的关联。乙酰基取代度与ζ-电位具有较为明显的正相关关系,但同时单糖组成和分子质量也对GMs的ζ-电位大小起到一定的作用。GMs的脂肪吸收能力由多个结构因素共同决定。根据以上结果推断GMs的分子质量、乙酰基取代度和单糖组成共同影响其理化性质。(7)比较了KGM、DOP和四种芦荟多糖在正常昆明小鼠肠道中的酵解特征。连续进行GMs膳食补充14天后,比较不同组别小鼠的生长情况,收集血清生化指标,测定盲肠内容物、结肠内容物和粪便(第7天和第14天收集)中短链脂肪酸(SCFAs)的浓度。结果显示,膳食补充GMs不会影响小鼠的正常生长。与正常组相比,仅部分生化指标在正常范围内有一定的波动。GMs在肠道中发酵后,短链脂肪酸水平发生明显的变化。KGM和DOP显著促进了盲肠内容物、结肠内容物和粪便中SCFAs的产生。芦荟叶表皮GMs主要影响结肠部位SCFAs的水平。数据分析显示分子质量和乙酰基取代能够正向促进GMs在肠道中发酵产SCFAs,M/G比值则呈相反的趋势。肠道SCFAs水平的升高表明几种GMs具有促进肠道健康的功能。综上,本论文确定了魔芋和芦荟多糖均为具有乙酰基取代的β-(1→4)-葡甘露聚糖,仅含少量(或不含)支链。乙酰基取代主要发生在主链甘露糖残基的O-2、O-3和(或)O-6位。结构上,几种GMs在分子质量、M/G比值、乙酰基取代度三个方面表现出较大差异。总体而言,魔芋多糖分子质量最高但M/G比值最低,芦荟多糖乙酰基含量最高,铁皮石斛多糖的乙酰基含量最低而分子质量和M/G比值处于中等水平。几种GMs在0.1 M NaNO_3溶液中均以无规卷曲构象为主,且具有线状、薄片状和球体等多种固体形貌特征。结构特性的不同导致了不同来源GMs的理化性质和肠道酵解特征的不同。
【图文】：

思路图

本论文的研究思路图

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第 2 章魔芋葡甘露聚糖的制备及结构解析溶物，，然后依次加入热稳定性 -淀粉酶和木瓜蛋白酶以除去淀粉和蛋魔芋多糖的分子质量分布如图 2.1 所示。根据所用葡聚糖标准品的分相对保留时间绘制标准曲线，得方程：Kav=-0.2885LogMw+=0.9937）。根据保留时间计算，发现 KGM、AGM、MGM 和 BGM 的质量逐渐增加，依次为 919、1,110、2,120 和 2,400 kDa。本试验所获多糖样品的分子质量与文献报道的疣柄魔芋（A. paeoniifolius）、东京.tonkinensis）[113]、桂平魔芋（A.guripingensis）、花魔芋（A.rivirei）的接近[114]。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS201.2;TS201.4

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