柱前衍生-HPLC法测定α-二羰基化合物的研究

发布时间：2020-06-13 04:43

【摘要】：α-二羰基化合物(α-dicarbonyl compounds,α-DCs)是糖化过程中重要的中间产物,也是形成晚期糖化产物的重要前体化合物。大量研究表明,在很多种类的食品中,尤其是经发酵获得的食品中都普遍存在该类化合物;同时,临床医学检测发现,一些慢性病,如糖尿病及其相关并发症、阿尔茨海默症、帕金森等的患者,其体液内(血液,尿液及透析液等等)α-DCs的水平与正常人的相比较明显偏高,这说明该类化合物在人体液内浓度的升高很可能与这些慢性病的发生发展密切相关。因此,建立检测α-DCs浓度的方法不仅有助于指导诸如糖尿病等慢性病患者日常饮食的选择及控制,更有助于监测这些慢性疾病的发生发展过程及探讨它们形成的机理。目前,国内外对于检测α-DCs的方法研究主要集中在柱前衍生-高效液相色谱法(HPLC)方面,所使用的衍生化试剂多以可与待测化合物形成喹喔啉结构的邻苯二胺及其衍生物和类似物为主,这主要因为所形成的喹喔啉结构具有稳定性好及紫外吸收灵敏等优点,易于实现HPLC分离及UV检测。但已有的这类衍生化试剂在进行衍生化反应时均需要加热或室温下长时间反应才能达到最佳反应结果,这无疑对准确定量不同样品中α-DCs带来诸多挑战。为改善这种研究状况,本课题通过合成新的衍生化试剂,建立了能够同时测定多种α-DCs的柱前衍生-HPLC-UV方法。新的检测方法具有反应条件温和(pH 9.0,室温下反应30 min)、测定便利、灵敏度高的优势。利用所建立的方法,我们测定了不同样品中,包括各种食品、糖尿病患者血液及唾液中α-DCs的含量,并对这些数据进行了相应的分析。首先通过合成新的衍生化试剂4-(2,3-二甲基-6-喹喔啉基)-1,2-邻苯二胺(DQB),建立了柱前衍生-HPLC法测定五种α-二羰基化合物:3-脱氧葡萄糖醛酮(3-DG),乙二醛(Gly),甲基乙二醛(MGly),2,3-丁二酮(DA),2,3-戊二酮(PD)含量的方法。最佳的衍生化条件确定为:反应pH值为9.0,室温下反应30 min。五种化合物具有较宽的线性范围,良好的线性关系(R~2均0.99);检测限(LOD)分别为3-DG,0.05μM;Gly,0.05μM;MGly,0.05μM;DA,0.02μM;PD,0.025μM,说明该方法检测五种化合物具有较高的灵敏度。五种化合物的日内和日间的相对标准偏差(RSD)分别为0.34-2.70%以及0.34-2.06%;五种化合物的DQB衍生物至少可在室温下稳定24 h。其次,我们利用所建立的检测方法测定了不同食物样品中的α-DCs。对该方法测定食物样品中的五种α-DCs进行方法评价,结果显示这五种化合物的回收率在85.35%到105.38%之间,RSD在0.43%到4.07%之间,说明本方法用于测定食物样品中的α-DCs具有良好的准确性和可靠性。对不同食物样品进行检测分析的结果表明,酒类、碳酸饮料、奶制品、果味饮品、咖啡、茶类等十四种食物样品中均不同程度地含有这些α-DCs化合物。本次检测为食品质量评估提供了新的解决方案,同时也为诸如糖尿病等慢性病患者提供一定的膳食参考。此外,利用该检测方法对健康人及糖尿病患者血浆中的α-DCs进行定量分析及评估。该方法应用于血浆中α-DCs的检测进行的方法评价结果显示,五种α-DCs的回收率在84.38%到103.99%之间,日内和日间RSD分别在1.28-5.69%和2.26-6.34%的范围内,并且衍生物在4℃下至少可稳定24 h。在此基础上测定了50名2型糖尿病(T2DM)患者(其中包括15名糖尿病肾病患者)和47名健康受试者血浆样品中五种α-DCs的含量,发现糖尿病患者血浆中3-DG,Gly和MGly的水平均显著高于健康受试者,糖尿病肾病(DN)患者中Gly和MGly的含量高于单纯T2DM患者。在此基础上,我们对T2DM患者血浆中Gly,MGly和3-DG水平进行了相关性分析,结果表明患者3-DG,Gly以及MGly水平与糖化血红蛋白(HbA1c)以及空腹血糖呈正相关性,Gly和MGly与尿微量白蛋白之间存在中高度正相关。这也是首次发现Gly可能在糖尿病肾病的发展中具有一定的生物学意义。同时,首次检测了人唾液中的α-DCs含量。该方法应用于唾液中α-DCs检测的方法评价,结果表明:五种α-DCs的回收率在80.26%到100.63%之间,RSD在0.34%到4.64%之间,日内和日间RSD分别在0.82%和3.41%的范围内,并且这些衍生物在4℃下至少可稳定24 h。在此基础上,我们测定了23名T2DM患者和15名健康者的唾液样品中五种α-DCs的含量,发现糖尿病患者唾液中Gly和MGly的水平明显高于健康受试者。此外,还评估了两组受试者唾液中葡萄糖的水平,结果表明T2DM患者唾液葡萄糖水平显著高于健康对照组,并发现T2DM患者唾液葡萄糖与空腹血糖及糖化血红蛋白具有正相关性。最后,我们还以DQB为衍生化试剂检测了另一种α-DC,即D-葡糖醛酮(GS),所确定的最佳的衍生化条件为pH 5.0,80℃下反应50 min。方法评价结果显示,检测GS在1-150μM的范围内线性关系良好(R~2=0.993),LOD为0.01μM,RSD5%。应用所建立的GS检测方法定量分析了人血浆中GS水平,包括50名2型糖尿病患者及47名健康受试者,研究结果表明T2DM患者血浆中GS的平均水平高于健康对照组,并与糖化血红蛋白以及空腹血糖具有良好的正相关性。本课题在合成α-DCs类化合物的衍生化试剂DQB的基础上,建立并评价了利用柱前衍生-HPLC检测不同样品中α-DCs含量的方法,确定了各种食品及糖尿病患者血液及唾液中该类化合物的浓度,得到了预期的实验结果。本研究的意义在于:1)通过测定各种食品中α-DCs的含量为糖尿病等慢性病患者提供一定的膳食参考;2)通过测定糖尿病患者的血液和唾液样品中α-DCs的浓度并将其与健康对照者的测定结果进行对比分析,探究了体内这些α-DCs化合物的水平与糖尿病及其慢性并发症发生发展的关系,为糖尿病及其并发症的筛查和监测提供了一些有效的方法。
【图文】：

高血糖,身体的,糖尿病,氧化应激

第一章绪论号通路的正常传导而改变蛋白功能[26]，并激发氧化应激和羰基应组织损伤的病理过程[27]。另一方面，，分子间胶原蛋白由于 AGEs顺应性降低，血管僵度增加，舒张功能障碍，从而诱发动脉粥样实验同样表明，高水平的外源性 AGEs 同样会促进肾脏和血管并

糖尿病并发症,病理机制

西北大学博士学位论文活P21ras使丝裂原活化蛋白（MAP）激酶活化，导致氧化应激和核因子κB（[36]。NF-κB 通过调节内皮素-1 的基因转录，使组织因子、血小板调节因等释放增加，如白细胞介素-1α（IL-1α）、白介素-6（IL-6）、肿瘤坏死-α）以及粘附因子增加包括血管细胞粘附分子（VCAM-1），细胞间粘附M-1）等[37]。还有研究表明，除了促进炎性因子的释放外，AGEs 与 RA中结合后，使NF-κB和血红素加氧酶mRNA（氧化应激标志物）结合，激活氧（ROS）产生增加[38,39]，以及当内皮细胞直接接触高浓度的葡萄糖时同S 的形成（作用机制见图 2）[40]。这些因素，均是导致糖尿病肾病，糖尿糖尿病神经病变等并发症的关键病理因素。AGEs 的形成是糖尿病并发症并且不具有血糖依赖性[41]；因此，了解和监测 AGEs 的来源至关重要。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS207.3;O657.72

【参考文献】