酿酒酵母高效表面展示β-葡萄糖苷酶提高葡萄酒香气的研究

发布时间：2020-06-20 21:49

【摘要】：葡萄酒中的萜类物质大多以结合态糖苷的形式存在,不易释放。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BGL)在糖苷水解过程中至关重要,然而在葡萄酒酿造过程中,其活性往往受葡萄酒发酵环境,即高浓度葡萄糖、乙醇及低pH等因素的影响,并且商业酶制剂的稳定性差、固定化酶的生产成本高等不利因素限制了BGL在葡萄酒酿造过程中的使用。近年来,酿酒酵母表面展示技术作为全细胞生物催化被认为是最有前景的方法之一,将酶展示到细胞表面,不仅可使其在活性和稳定性方面显著高于游离酶,而且具有不消耗固定化材料以及可重复利用等特点,为BGL在提升葡萄酒香气方面的应用提供了新的解决思路。本论文将来源于黑曲霉的BGL展示在酿酒酵母细胞表面,通过优化载体、启动子、锚定蛋白以及转录融合伴侣(translational fusion partner,TFP)等策略实现BGL的高效稳定展示,同时探索了酿酒酵母表面展示BGL的酶学特性及其在发酵环境下对香气糖苷的水解能力。主要研究内容及结果如下:(1)以绿色荧光蛋白(GFP)为靶蛋白,Sag1p、Sed1p、Cwp2p为锚定蛋白,利用无缝克隆技术将其插入到包含诱导型启动子GAL1的高拷贝载体pYES2/CT/α-Factor中,通过激光共聚焦显微镜观察GFP的位置。结果发现阳性对照菌株PBy-eG表达的GFP存在于细胞质中,而实验组菌株PBy-eGSA、PBy-eGSE、PBy-eGCW所表达的GFP具有向外分泌的趋势,同时在细胞周围也不存在游离形式的GFP,表明了酿酒酵母表面展示平台搭建成功。(2)分别将已构建的三种绿色荧光蛋白锚定载体上的启动子GAL1更换为GPD和SED1的启动子,绿色荧光蛋白基因(eGFP)替换为BGL基因(bgl1),成功构建出表面展示BGL的高拷贝质粒,并将其电转入宿主菌BY4741中进行表达。结果发现;六株重组菌所展示的酶活均随培养时间的延长而降低,其中GPD启动子驱动的阳性重组菌所展示的酶活均高于SED1启动子的;三种锚定蛋白(Sag1p、Sed1p、Cwp2p)中Sag1p表现最好;因此携带质粒GPD-HQM-Sag1的重组菌PBy-GBSa能够更为高效地展示BGL,且当培养到24 h,酶活达到最大值18.29±1.05 U/g。(3)构建了以HIS3为重组臂,URA3为筛选标记的酵母整合型载体Yip-loxp-URA3,分别将已构建的六种表面展示BGL表达盒插入到整合型载体中,成功构建了表面展示BGL的整合型质粒,通过实时定量PCR(Real time PCR)和酶活测定监测BGL在整个发酵过程中的转录水平和蛋白表达水平。结果发现,SED1启动子的转录水平要高于GPD启动子的;在蛋白表达水平,六株重组菌所展示的酶活均随培养时间的延长而逐渐升高,当培养至84 h时,酶活达到最大值;以GPD启动子驱动的阳性重组菌所展示的酶活高于SED1启动子的,且sed1p作为锚定蛋白时,所展示的BGL活性达到最高(25.22±0.81 U/g)。(4)将已构建的表面展示BGL酶活最高的阳性重组菌BY-GSE所用质粒Yip-GPD-BGL-Sed1中的MFalpha1 TFP替换为来源于酿酒酵母的23个不同的TFPs,考察TFPs对表面展示BGL活性的影响。结果显示,所有的TFPs都可以使BGL成功地展示在酵母表面,其中13-HSP150、17-SED1(195 aa)、23-CCW14和24-SED1(170 aa)的菌株所展示的BGL活性高于原始菌BY-GSE,且17-SED1(195 aa)重组菌展示的酶活最高(74.58±5.88 U/g)。(5)以商业酶制剂AR2000作为对照,考察了表面展示的BGL在不同条件下(葡萄糖、pH和乙醇)的稳定性及其在模拟葡萄汁发酵过程中对香气糖苷的水解能力。结果显示,当葡萄糖浓度低于5%时,游离态酶的活性被完全抑制,而表面展示BGL酶活的受抑制程度明显减弱,保留了12%左右的残留活性;在pH 3.0时,表面展示BGL的残留活性在50%左右,而游离态酶仅有15%左右,高出3倍以上;乙醇对表面展示BGL和商业酶制剂AR2000都具有抑制作用,且抑制趋势相似,在20%(v/v)乙醇浓度下,均保留了50%以上的残留活性;利用酵母细胞表面展示BGL所释放的萜烯醇浓度是商业酶制剂AR2000(37.58±1.16μg/L)的2.1倍。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS262.6
【图文】：

葡聚糖,几丁质,β-葡聚糖,外界环境

酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是具有细胞壁的单细胞真核生物，其细胞细胞形态、保护细胞、代谢转运以及响应外界环境胁迫等方面发挥着重要的ndo and Ueda 2004)。酵母细胞壁主要由 β-葡聚糖、几丁质和甘露糖蛋白组成，质含量仅占 1.5%-6%，甘露糖蛋白占 30%~50%，其余则由 β-葡聚糖组成。在中，β-1,3 葡聚糖含量高于 β-1,6 葡聚糖(Matsuoka et al. 2014)。酵母细胞壁中主链为 β-1,3 葡聚糖，侧链为 β-1,6 葡聚糖，这种结构是特有的三重超微螺旋电镜下观察，酵母细胞壁厚度约为 200 nm，细胞壁内部由葡聚糖组成，外部蛋白组成。酵母细胞壁的内层主要由 β-1,3 葡聚糖和几丁质组成，几丁质含量，却是酵母细胞壁的骨架。β-1,3 葡聚糖与几丁质相连交织成有弹性的纤维网图 1-1A）(Manners et al. 1973)。甘露糖蛋白在酵母细胞壁的最外层，其高度大多数甘露糖蛋白通过共价键直接或间接与 β-1,3 葡聚糖相连（图 1-1B）(Lipvalle 1998)。甘露糖蛋白可参与细胞间的信息交流或者黏连，阻止外界环境干新陈代谢(Klis et al. 2006)。另外，酵母细胞壁可根据外部环境进行自由收缩，渗透压条件时会迅速收缩，当渗透胁迫解除后，又恢复其最初的形状，这是的过程(Klis et al. 2002)。

转移过程,信号肽

第一章文献综述接区（linker region）和一段有 15-22 个氨基酸组成的疏水区（hydropho and Conzelmann 2007；Kinoshita and Fujita 2009)。GPI 锚定蛋白的转移过网中，从 ω 位点切除 C 端信号肽，随后糖基化的磷脂酰肌醇与 GPI 锚定然真核生物中都存在 GPI 锚定蛋白，但是不同物种中的 GPI 锚定蛋白的不能通用，即来源于哺乳动物细胞中的 C 端信号肽不能被酵母细胞所识将蛋白固定在细胞表面，然而所有物种中的 GPI 锚定蛋白 C 端信号肽也性，即插入到膜内的表面自由能 ΔGapp < 2.5 千卡摩尔时，才能发挥出信Galian et al. 2012)，如图 1-2 所示。

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