加工番茄中α-Man和β-Hex对其果实成熟软化的影响

发布时间：2020-07-05 04:18

【摘要】：加工番茄是新疆的支柱性产业之一,种植面广,产量高,是新疆经济发展的重要助力部分。番茄属于呼吸跃变型果实,在成熟过程中乙烯产量骤增、果实快速软化。因此,探索能够抑制番茄果实过度软化、延长货架期、便于储存运输、增加销售品质的方法显得尤为重要。游离N-聚糖广泛存在于植物细胞的各个细胞器中,参与果实的成熟软化。糖苷水解酶α-甘露糖苷酶(a-Man)和β-DN-乙酰氨基己糖苷酶(β-Hex)属于不同的糖基水解酶家族,二者都是N-聚糖加工过程中的关键酶,并且在果实成熟期间特异性表达,可以促进游离N-聚糖的产生,加速番茄果实成熟软化。目的:在加工番茄中建立CRISPR/Cas9基因编辑体系,靶向编辑加工番茄内源基因a-Man和β-Hex,获得a-Man和β-Hex基因失活、功能丧失的突变体番茄植株。从而抑制N-糖蛋白降解、减弱番茄成熟期果实的软化程度,为延长番茄采后保质期提供技术支持。方法:实验根据α-Man和β-Hex基因序列全长,筛选合适的编辑靶点,确定靶序列,并在α-Man和β-Hex基因的第一个外显子上设计单个guide RNA(gRNA),由番茄U6启动子驱动表达,以及串联的两个sgRNA,由RNA聚合酶Ⅱ启动子驱动表达,分别构建单靶点和双靶点植物表达载体,指导由35S启动子驱动表达的Cas9核酸酶作用于目的基因;首先以野生型加工番茄成株为实验材料,通过瞬时转化验证双靶点编辑载体的有效性;其次以番茄子叶、叶柄和茎段作为外植体,对加工番茄进行农杆菌介导的遗传转化;通过限制性内切酶酶切结合PCR扩增的方法检测基因编辑情况,并经过单克隆测序确定α-Man或β-Hex基因突变体。结果:构建了基于CRISPR/Cas9系统的植物表达载体pKAN-sgR-Cas9-Man和pKAN-sgR-Cas9-Hex,以及用于双靶点编辑的载体pDIRECT-Man和pDIRECT-Hex;经遗传转化获得14个α-Man基因独立转化事件,6个β-Hex基因独立转化事件;对转基因加工番茄α-Man和β-Hex基因编辑效果进行检测,结果表明14株α-Man转基因番茄植株有两株检测到突变现象,而β-Hex转基因植株均未检测到突变现象。α-Man突变体TA克隆测序结果显示有两种编辑类型,一种表现为52 bp的indel突变,导致α-Man基因序列发生移码突变,功能丧失。另一种表现为单碱基突变,且均为A-G或C-T转换,说明单靶点敲除载体编辑效率低。此外,双靶点编辑载体瞬时转化番茄成株也没有检测到突变现象,载体编辑效果有待进一步验证。结论:本研究实现了对加工番茄α-Man酶基因的编辑,获得了α-Man基因功能丧失的移码突变体。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS255.1
【图文】：

sgRNA表达框示意图

植物表达载体结构示意图

【参考文献】

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本文编号：2742072