反胶束体系中酶法合成β-谷甾醇月桂酸酯及其降胆固醇功能的研究

发布时间：2020-07-12 07:05

【摘要】：植物甾醇是一种有效的降血胆固醇功能因子,但游离植物甾醇在油和水中溶解性差、熔点高,人体吸收和有效利用的效率差,也使其难以在食品和药品中广泛应用。为了解决这一问题,业界一般将植物甾醇衍生成植物甾醇酯。植物甾醇酯同样具有显著的降胆固醇功效,而其较高的脂溶性和较低的熔点提高了机体的吸收率,同时便于在食品和医药中应用。目前植物甾醇酯主要在无溶剂或有机体系中通过脂肪酶催化合成,但反应时间长、合成效率低。为了解决这问题,本文以β-谷甾醇月桂酸酯(β-SLE)为合成目标,通过构建反胶束(RM)酶体系,研究了其合成新方法,并且通过动物实验,探讨β-SLE降脂和降胆固醇的功能及其机理。主要研究结果如下:1.通过动态光散射技术确认构建了以Candida Rugosa lipase AY30(CRL AY30)为催化剂的水/双(2-乙基己基)琥珀酸酯磺酸钠(AOT)/异辛烷RM酶体系。通过逐步优化法优化RM酶体系结构,发现采用pH值为7.5的50 mmol/L磷酸缓冲盐溶液作为亲水核包裹CRL AY30,并且[CRL AY30](mg/mL):[水](mmol/L):[AOT](mmol/L)=3:375:25时,酶具有最大催化活性,且高于其在25 mmol/L AOT/异辛烷体系、375 mmol/L水/异辛烷体系或异辛烷体系中的活性。以β-谷甾醇25 mmol/L、醇酸比1:4、酶载量10%(w%总反应物)、反应温度45℃的条件反应24 h后可合成55.62%β-SLE,48 h后合成72.71%β-SLE。上述结果表明水/AOT/异辛烷RM酶体系可用于β-SLE的合成。2.优化了水/AOT/异辛烷RM酶体系中合成β-SLE的条件。采用薄层色谱法、高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法和红外光谱法等定性方法确定β-SLE的合成,并采用高效液相色谱法(HPLC)对其进行定量检测。经单因素实验和响应面优化后得最佳条件为:醇酸摩尔比1:3.5(25 mmol/Lβ-谷甾醇)、酶载量18%(w%总反应物)、反应温度47℃、反应时间48 h,最终β-SLE的合成率为86.82%。3.以叙利亚金黄地鼠为动物模型,用0.2%胆固醇饲料和花生油建立高甘油三酯高胆固醇血症模型,用低(11 mg/100 g体重)、中(22 mg/100 g体重)和高(44 mg/100 g体重)剂量的β-SLE连续灌喂6周,通过分析血清脂质、肝脏脂质、附睾脂肪和肝细胞形态、肝脏总脂肪酸组成后发现,β-SLE表现出显著地降胆固醇效果,其中中剂量组效果最佳。较于模型组,中剂量组血清和肝脏中的总胆固醇分别显著下降20.1%和33.6%(P0.05)。同时,β-SLE表现出显著地降脂效果和调节脂质代谢的功能,其中中剂量组效果最佳。较于模型组,中剂量组血清和肝脏中的总甘油三酯分别下降30.9%(P0.05)和13.6%,且附睾脂肪组织和肝细胞减小最为明显。此外,中剂量组的饱和脂肪酸及不饱和脂肪酸占比最接近空白对照组,分别为35.32%和63.19%(中剂量组),37.62%和60.75%(对照组),其n-6多不饱和脂肪酸与n-3多不饱和脂肪酸比值最佳,为4.32,以及中链脂肪酸占比最高,为模型组的3.00倍。通过测定肝脏功能性酶发现,β-SLE可提高肝脏谷胱甘肽-S-转移酶(GST)的活性,相较于模型组,低、中和高剂量组的GST活性分别显著提高59.4%、68.8%和66.2%(P0.05)。4.通过HPLC对粪便胆固醇含量进行测定。结果显示,较于模型组,低、中和高剂量组中每克粪便胆固醇分别显著提高13.2%、21.4%和65.9%(P0.05),表明β-SLE可以抑制膳食胆固醇的吸收。胆固醇小肠吸收相关酶的Elisa分析结果显示,β-SLE主要通过抑制尼曼匹克C1类1蛋白1(NPC1L1)的表达来抑制胆固醇的吸收,其中中计量组效果最佳,相较于模型组,中剂量组可显著下调22.6%的NPC1L1表达量(P0.05)。此外,相较于模型组,高摄入量的β-SLE可显著抑制8.5%和9.3%的乙酰辅酶A乙酰基转移酶-2和微粒体甘油三酯转运蛋白表达量(P0.05)。通过超高速液相色谱-三重四级杆串联质谱法对肝脏胆汁酸和粪便胆汁酸进行测定发现,肝脏中低、中和高剂量组总胆汁酸(TBA)含量随剂量增大而增大,分别为148.018、281.303和830.205 ng/mg prot,均显著低于模型组(P0.05),但中和高剂量组显著高于对照组(P0.05)。粪便中低、中和高剂量组TBA含量也随剂量增大而增大,分别为1030.507、1430.901和1566.969ng/mg prot,均显著低于模型组但高于对照组(P0.05)。这些结果表明β-SLE可能可直接促进胆固醇在肝脏中分解合成胆汁酸和/或促进胆汁酸的排泄,间接促进胆固醇在肝脏中分解合成胆汁酸。进一步对肝脏中胆汁酸合成相关酶进行Elisa分析,结果显示,相较于模型组,低、中和高剂量组可显著上调7.6%、16.9%和12.3%的胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)表达量(P0.05),中和高剂量组可显著上调31.%和21.7%的甾醇27羟化酶(CYP27A1)表达量(P0.05)。回肠中胆汁酸重吸收相关酶的Elisa分析结果显示,相较于模型组,低和中剂量组可显著下调17.7%、14.5%的回肠顶端钠依赖型胆汁酸转运体表达量(P0.05)。这些结果表明β-SLE可能通过促进胆汁酸的排泄,从而促进胆固醇在肝中分解合成胆汁酸。此外,β-SLE对回肠胆汁酸结合蛋白(IBABP)、回肠法尼酯X受体(FXR)和肝脏FXR的表达具有抑制作用,这些酶的减少同样可能减少CYP7A1和CYP27A1的表达。考虑到高剂量组效果最佳,分别显著性抑制28.7%、39.4%和26.4%的IBABP、回肠FXR和肝脏FXR表达量(P0.05),故β-SLE可能可直接作用于肝脏促进胆固醇分解,但需进一步证明。总之,β-SLE降胆固醇的机制可能为:1)降低胆固醇在小肠中的吸收;2)抑制胆汁酸在回肠中的重吸收,促进胆汁酸的排泄,从而促进胆固醇在肝中分解合成胆汁酸。
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O629.2;TS201.4
【图文】：

植物甾醇,胆固醇

图 1.1 胆固醇及四种主要植物甾醇的结构Figure 1.1 The structure of cholesterol and four main kinds of phytosterols植物甾醇酯是植物甾醇的一类酯衍生物，一般由植物甾醇与脂肪酸通过酯化反应制得。游离的植物甾醇由于上述结构，在水和油脂中的溶解性都较差，且几乎不溶于冷乙醇和丙酮，但易溶于氯仿和醚类，此外，其对热和化学药品很稳定，熔点为 140~170℃[16]，这种性质使其人体吸收和有效利用的效率差，也使其难以在食品和药品中广泛应用[8]，与之相比，植物甾醇酯的熔点降低，油溶性提高，能增加 20 ~ 40%的生物利用率[10]，并且植物甾醇酯在人体小肠内会被水解成游离的植物甾醇[17]，故能保持与植物甾醇相似的降胆固醇功效[9]。表 1.1 主要油脂脱臭馏出物中的植物甾醇酯含量Table 1.1 The content of phytosterols in some main oil deodorizer distillate馏出物来源含量（%）馏出物来源含量（%）大豆油 9 ~ 12 米糠油 4.9 ~ 19.2

示意图,卡通,三元相图,表面活性剂

该体系成为酶体系，可作为酶催化反应媒介[80]，如图1.2 所示[81,82]，由于酶被包裹在极性核中，不与有机物质接触，其催化活性得以保护[83]，且极性核呈纳米水平分散，增加酶的扩散系数[84]，而非极性连续相又可以作为疏水性底物的合适溶剂，保证其反应浓度，解决了酶在非极性溶剂中活性低、底物在极性溶剂中溶解度低、两者无溶剂中均扩散系数低的问题，最终提高反应效率。姜崇斌[85]等人利用 Novozym 碱性蛋白酶，在椰油酰胺丙基甜菜碱/正庚烷/正己醇 RM 酶体系中提取大豆蛋白，最终将提取率提高了 15.20%，达到74.28%；何进星[86]将乳酸脱氢酶固定在十六烷基三甲基溴化铵/辛烷/己醇 RM 中，并且将其用于测定试样中乙醇的含量；王伟伟[87]研究了纤维素酶在鼠李糖脂 RM酶体系中降解纤维素的反应

示意图,构象,位点,高胆固醇血症

图 1.3 Rhizomucor miehei 脂肪酶活性位点的封闭（a）和开放（b）构象的卡通示意图igure 1.3 Cartoon representation of the closed (a) and open (b) conformation of the active sitethe lipase from Rhizomucor miehei植物甾醇及酯降胆固醇功能研究的现状高胆固醇血症概述临床上将高脂血症简单分为三类，分别为高甘油三酯高胆固醇血症、高胆血症及高甘油三酯血症，其中高胆固醇血症表示血中 TC 含量超过 mol/L[98]。Song[99]等人通过比较 2002 年和 2010 ~ 2012 年国人营养与健康相据发现，我国的血TC从2002年的3.93mmol/L上升到2012年的4.62mmol/L胆固醇血症的患病率更是从 1.6%上升到了 6%。普遍认为，血 TC 或 LDL-C量与患动脉粥样硬化疾病的风险呈现正相关，而动脉粥样硬化又会进一步心血管疾病（冠心病）。据统计，心血管疾病是全球主要的死亡原因，2016亡人数超过 1760 万，预计到 2030 年将增加到 2360 万以上，而 2019 年冠[1]

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