改良型免疫侧向层析瘦肉精莱克多巴胺检测新方法研究
发布时间：2020-07-18 23:33
【摘要】：瘦肉精莱克多巴胺是对人体危害极大的非法畜牧养殖添加剂,如果人误食了含有莱克多巴胺的肉制品,其身体健康会受到严重损害,所以对莱克多巴胺进行快速现场检测对从源头把控肉制品产品的安全具有重要意义。因此,本文建立了莱克多巴胺的三种免疫侧向层析快速检测方法:(1)传统型免疫侧向层析试纸瘦肉精莱克多巴胺检测方法的建立本方法是基于免疫识别原理和侧向层析实验原理对莱克多巴胺进行试纸检测,在金纳米粒子表面标记莱克多巴胺单克隆抗体,T线固定莱克多巴胺抗原,C线固定羊抗鼠二抗,肉眼通过观察T线和C线是否显现定性分析莱克多巴胺的存在状况,结合扫描线条灰度进行莱克多巴胺定量分析。本实验对偶联抗体量、偶联时碳酸钾添加量、封闭剂种类和金标垫滴加体积关键实验参数进行优化,在最优实验条件下,对莱克多巴胺的检测在10 min内完成,裸眼观察的灵敏度为0.5 ppb,标准曲线检测线性范围为0.05-2 ppb。本方法同样适用于检测动物尿液中的莱克多巴胺含量,检测结果与标准品检测结果高度一致,不受基质效应干扰。(2)增敏型免疫侧向层析试纸瘦肉精莱克多巴胺检测方法的建立本方法是在传统免疫侧向层析试纸检测的基础上增加一个增敏金标垫,增敏垫上为羊抗鼠二抗与金纳米粒子偶联物,利用羊抗鼠二抗对金纳米粒子的莱克多巴胺抗体二次识别作用增强T线显色和变化强度使检测灵敏度得到显著提高。本实验对增敏抗体偶联量、样品垫处理液成分、封闭物和金纳米粒子直径进行优化,确定最佳实验参数。在最优实验条件下,对莱克多巴胺的检测在10 min内完成,裸眼观察灵敏度为0.05 ppb,相比于传统方法提高了10倍。标准曲线线性范围为0.005-0.2 ppb。本方法同样适用于检测动物尿液中的莱克多巴胺含量,检测结果与标准品检测结果高度一致。(3)多壁碳纳米管标记免疫侧向试纸瘦肉精莱克多巴胺检测方法的建立本方法是基于竞争法免疫侧向层析试纸检测原理,用多壁碳纳米管标记莱克多巴胺单克隆抗体建立免疫侧向层析试纸,对莱克多巴胺进行快速检测。多壁碳纳米管具有比表面积大、表面化学性质可控等优点,但是由于其分散性差和体积大,在侧向层析领域的应用较为薄弱。本方法在多壁碳纳米管表面标记莱克多巴胺单克隆抗体,T线固定莱克多巴胺抗原,C线固定羊抗鼠二抗,肉眼通过观察T线和C线是否显现定性分析莱克多巴胺的存在状况,结合扫描线条灰度进行莱克多巴胺定量分析。本实验对多壁碳纳米管的前处理方法、偶联抗体体积、封闭剂种类、重悬液中聚乙二醇浓度和重悬液体积进行优化,确定了最佳实验参数。在最优实验条件下,对莱克多巴胺的检测在10 min内完成,裸眼观察的灵敏度为0.5 ppb,标准曲线的线性检测范围为0.05-2 ppb。本方法同样适用于检测动物尿液中的莱克多巴胺含量,检测结果与标准品检测结果一致,不受基质干扰。所以利用多壁碳纳米管进行标记建立的免疫侧向层析试纸检测的灵敏度不输于传统金纳米粒子标记,为下一步多壁碳纳米管在免疫侧向层析试纸上的深度应用奠定基础。
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS251.7
【图文】：
本文应用的是多壁碳纳米管。多壁碳纳米管是由多层石墨层卷成的同轴管状碳分子，如图1.1 所示。多壁碳纳米管的径向尺寸较小，在纳米级量，最小内径为 0.4 nm，而长度是微米级量，最长可达数毫米。多壁碳纳米管具有耐热、耐腐蚀、导热好、导电性好[20,21]等优良特性，其特有的螺旋中空管状结构又赋予了多壁碳纳米管的优异的力学[22,23]、电学、热学、储氢[24]等性能，同时，由于其体积微小、比表面积大、表面化学性质可控，使多壁碳纳米管在纳米技术领域和材料领域得到广泛应用。多壁碳纳米管在纳米技术领域使用时，一般在多壁碳纳米管表面修饰羧基[25]，但其在一般溶液中分散性较差，因而限制了其在生物传感器、生物检测等领域中的应用。所以，用物理法和化学法对多壁碳纳米管进行处理迫在眉睫，使其长径比降低，表面性质改变，使碳纳米管的溶解性和分散性得到极大改善[26]，从而具备了作为载体的良好条件，广泛应用于免疫检测领域。图 1.1 多壁碳纳米管结构图Fig 1.1 Structure of MWNTs1.4 瘦肉精莱克多巴胺检测方法研究及进展目前莱克多巴胺的检测方法主要是色谱技术和快速检测法。色谱技术是基于大型仪器的传统仪器分析方法，主要分为高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱/质谱连用法（LC-MS）[27]、气象色谱/质谱连用法（GC-MS）、高效毛细管电泳等方法（HPCE）等。这些方法具有灵敏度高
分析化学领域的研究热点[47,48]。Li 等[49]开发了一种高效毛细管电泳合的快速检测平台，对饲料中的三种瘦肉精进行检测，检测过程可成，其中莱克多巴胺的检测限为 2 nmol/L。光分析法，即将荧光核酸染料与适配体结合作为特异性荧光探针对测。Zhu 等[50]使用特异性荧光适配体对莱克多巴胺进行检测，通过对目标物进行定量分析，检测限达到 50 pM，平均回收率为 95%-11色法，酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）[51]，与 HPLC 检测法相比更为灵敏、快捷和低廉，但重复性与专 法差，因此适用于大批量样品的快速初筛[52,53]。Han 等[54]建立了基色酶联免疫吸附方法，来测定绵羊尿液中的莱克多巴胺，检出限低。Wang 等[55]提出了一套基于适配体的比色法，如图 1.2 所示，通过物（MIP）进行富集和分离莱克多巴胺，胶体金颜色的改变指示了浓度，检测限低至 10 ng/mL。Xiong 等[56]开发了一种基于多酚氧化酚类瘦肉精的比色法，实现了对莱克多巴胺，异苏普林，利托君和异性检测和超灵敏检测。
图 1.3 电化学分析法检测莱克多巴胺Figure 1.3 RAC Detection by electrochemical analytical method表面增强拉曼（Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS）是用拉曼光谱法定吸附在金属颗粒如银金、银或铜表面的样品，或吸附在这些金属的粗糙表面样品[67,68]。表面增强拉曼克服了普通拉曼检测灵敏度的问题，排除了环境干扰素，提高了检测准确性[69]。Zhai 等[70]用简单的固液萃取和液液萃取方法从实际尿中提取莱克多巴胺，用表面增强拉曼检测猪尿的提取结果，检测灵敏度为 μg/mL。Yu 等[71]建立了一种用表面增强拉曼对莱克多巴胺和盐酸克伦特罗进高灵敏双重免疫检测，和普通免疫检测方法相比，拉曼有更广的检测范围（1-00 pg/mL），检测灵敏度为 1.0 pg/mL。侧向层析检测技术（Lateral flow assay），分为基于免疫识别和适配体为基础测目标物[72]。目前虽然有很多瘦肉精莱克多巴胺适配体的报道[73]，但由于侧向析检测的反应环境限制和适配体的特异性识别能力仍需提高，所以对于瘦肉精克多巴胺的侧向层析检测仍以抗体包被原为基础。Zhang 等[74]利用胶体金免疫向层析试纸对莱克多巴胺和盐酸克伦特罗进行双重检测，肉眼观察的检测灵敏
本文编号：2761573
【学位授予单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS251.7
【图文】：
本文应用的是多壁碳纳米管。多壁碳纳米管是由多层石墨层卷成的同轴管状碳分子，如图1.1 所示。多壁碳纳米管的径向尺寸较小，在纳米级量，最小内径为 0.4 nm，而长度是微米级量，最长可达数毫米。多壁碳纳米管具有耐热、耐腐蚀、导热好、导电性好[20,21]等优良特性，其特有的螺旋中空管状结构又赋予了多壁碳纳米管的优异的力学[22,23]、电学、热学、储氢[24]等性能，同时，由于其体积微小、比表面积大、表面化学性质可控，使多壁碳纳米管在纳米技术领域和材料领域得到广泛应用。多壁碳纳米管在纳米技术领域使用时，一般在多壁碳纳米管表面修饰羧基[25]，但其在一般溶液中分散性较差，因而限制了其在生物传感器、生物检测等领域中的应用。所以，用物理法和化学法对多壁碳纳米管进行处理迫在眉睫，使其长径比降低，表面性质改变，使碳纳米管的溶解性和分散性得到极大改善[26]，从而具备了作为载体的良好条件，广泛应用于免疫检测领域。图 1.1 多壁碳纳米管结构图Fig 1.1 Structure of MWNTs1.4 瘦肉精莱克多巴胺检测方法研究及进展目前莱克多巴胺的检测方法主要是色谱技术和快速检测法。色谱技术是基于大型仪器的传统仪器分析方法，主要分为高效液相色谱法（HPLC）、液相色谱/质谱连用法（LC-MS）[27]、气象色谱/质谱连用法（GC-MS）、高效毛细管电泳等方法（HPCE）等。这些方法具有灵敏度高
分析化学领域的研究热点[47,48]。Li 等[49]开发了一种高效毛细管电泳合的快速检测平台，对饲料中的三种瘦肉精进行检测，检测过程可成，其中莱克多巴胺的检测限为 2 nmol/L。光分析法，即将荧光核酸染料与适配体结合作为特异性荧光探针对测。Zhu 等[50]使用特异性荧光适配体对莱克多巴胺进行检测，通过对目标物进行定量分析，检测限达到 50 pM，平均回收率为 95%-11色法，酶联免疫吸附（Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）[51]，与 HPLC 检测法相比更为灵敏、快捷和低廉，但重复性与专 法差，因此适用于大批量样品的快速初筛[52,53]。Han 等[54]建立了基色酶联免疫吸附方法，来测定绵羊尿液中的莱克多巴胺，检出限低。Wang 等[55]提出了一套基于适配体的比色法，如图 1.2 所示，通过物（MIP）进行富集和分离莱克多巴胺，胶体金颜色的改变指示了浓度，检测限低至 10 ng/mL。Xiong 等[56]开发了一种基于多酚氧化酚类瘦肉精的比色法，实现了对莱克多巴胺，异苏普林，利托君和异性检测和超灵敏检测。
图 1.3 电化学分析法检测莱克多巴胺Figure 1.3 RAC Detection by electrochemical analytical method表面增强拉曼（Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS）是用拉曼光谱法定吸附在金属颗粒如银金、银或铜表面的样品，或吸附在这些金属的粗糙表面样品[67,68]。表面增强拉曼克服了普通拉曼检测灵敏度的问题，排除了环境干扰素，提高了检测准确性[69]。Zhai 等[70]用简单的固液萃取和液液萃取方法从实际尿中提取莱克多巴胺，用表面增强拉曼检测猪尿的提取结果，检测灵敏度为 μg/mL。Yu 等[71]建立了一种用表面增强拉曼对莱克多巴胺和盐酸克伦特罗进高灵敏双重免疫检测，和普通免疫检测方法相比，拉曼有更广的检测范围（1-00 pg/mL），检测灵敏度为 1.0 pg/mL。侧向层析检测技术（Lateral flow assay），分为基于免疫识别和适配体为基础测目标物[72]。目前虽然有很多瘦肉精莱克多巴胺适配体的报道[73]，但由于侧向析检测的反应环境限制和适配体的特异性识别能力仍需提高，所以对于瘦肉精克多巴胺的侧向层析检测仍以抗体包被原为基础。Zhang 等[74]利用胶体金免疫向层析试纸对莱克多巴胺和盐酸克伦特罗进行双重检测，肉眼观察的检测灵敏
【参考文献】
相关期刊论文 前3条
1 罗燕;李俊演;谭磊;;动物尿液中莱克多巴胺的检测方法分析[J];国外畜牧学(猪与禽);2010年04期
2 方耀国;张炳财;郑志东;王卓南;林慕群;;莱克多巴胺的检测方法[J];畜牧兽医科技信息;2009年05期
3 刘丽;潘明飞;何金兴;闫艳平;王硕;;动物源性食品中莱克多巴胺的检测[J];食品与机械;2009年02期
相关硕士学位论文 前3条
1 李超辉;胶体金免疫层析试纸条定量检测猪尿以及猪肉中的克伦特罗残留[D];南昌大学;2014年
2 黄晓明;莱克多巴胺胶体金试纸条生产工艺研究[D];暨南大学;2011年
3 贺铁明;食品中残留克伦特罗酶免疫检测的研究[D];江南大学;2004年
本文编号：2761573
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/qgylw/2761573.html
