裸体方格星虫活性肽的酶法制备及其免疫活性的研究

发布时间：2020-07-25 07:25

【摘要】：裸体方格星虫(Sipunculus nudus L.)(以下全文简称方格星虫)主要分布在海南、广西、广东和福建沿海,是一种高蛋白、高营养价值的水产品。目前,关于方格星虫的活性研究主要包括抗氧化、抗菌、抗病毒、抗辐射、降血压、改善学习记忆、抗疲劳和免疫调节等。在方格星虫免疫活性研究方面,活性成分主要是多糖和粗提物,对于方格星虫蛋白的免疫活性研究很少,因此方格星虫免疫活性肽还有很大的研究空间。本文以方格星虫为原料,对方格星虫蛋白的理化特性进行研究;通过pH调节法制备分离蛋白,研究分离蛋白的酶解工艺;通过体外细胞实验和体内动物实验验证酶解产物各超滤组分的免疫活性;以体外免疫活性为评价指标对超滤组分进行活性追踪,通过分离纯化和质谱鉴定确定免疫活性肽的氨基酸序列,皆在为开发方格星虫高值化利用和免疫产品提供理论依据。主要研究内容和结果如下:(1)方格星虫是一种高蛋白低脂肪的水产品,蛋白含量和脂肪含量分别占原料干基的80.87%和2.37%。在方格星虫蛋白组成中,水溶性蛋白、盐溶性蛋白和不溶性蛋白分别占总蛋白的19.05%、43.58%和29.35%。SDS-PAGE电泳分析显示,水溶性蛋白主要在6 kDa-200 kDa范围内,盐溶性蛋白主要在29-50 kDa和66-200 kDa范围内,不溶性蛋白在48 kDa、102.3 kDa和200 kDa附近存在明显条带。方格星虫组成蛋白氨基酸种类齐全,3种组成蛋白与免疫相关的碱性氨基酸和疏水氨基酸含量均超过总氨基酸的50%。DSC结果显示,方格星虫水溶性蛋白、盐溶性蛋白和不溶性蛋白的变性温度分别为77.9℃、69.2℃和54.9℃。(2)以小鼠脾淋巴细胞的增殖率为指标,通过酶筛选实验确定动物蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶(复合比例1:1)为实验用酶。通过单因素和响应面优化方格星虫分离蛋白酶解实验,确定最优酶解条件为液料比(v/m)5:1、时间4.5 h、加酶量2460 U/g、温度56℃在该条件下脾淋巴细胞的增殖率值为60.22%,与该模型预测值60.61%相近(p0.05)。(3)方格星虫酶解产物经过超滤分级得到2.5 kDa组分和2.5 kDa组分;体外细胞实验表明:2.5 kDa组分和2.5 KD组分分别在浓度为0.6 mg/mL和0.9mg/mL时免疫活性最好,并且2.5 kDa组分(0.6 mg/mL)的免疫活性高于2.5 kDa组分(0.9 mg/mL)(p0.05);体内动物实验表明:方格星虫2.5 kDa组分的3个剂量组均能够增强小鼠细胞免疫功能、体液免疫功能、单核-巨噬细胞功能和NK细胞活性,通过《保健食品检验与评价技术规范》中增强免疫力功能检验方法判定方格星虫2.5 kDa组分有助于增强免疫力。(4)以体外免疫活性为评价指标对2.5kDa组分进行活性追踪,利用Sephadex G-25凝胶层析和Symmetry C_(18)高效液相色谱进行分离纯化得到高活性组分F_(431),最终对F_(431)组分进行质谱分析,结果表明免疫活性肽的氨基酸序列为苯丙氨酸-赖氨酸(FK)或苯丙氨酸-谷氨酰胺(FQ)。
【学位授予单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：TS254.1
【图文】：

电泳图谱,蛋白S,活性肽,氨基酸

裸体方格星虫活性肽的酶法制备及其免疫活性的研究。3 种方格星虫组成蛋白的必需氨基酸含量稍有不同，其中水和不溶性蛋白分别为 30.55%、37.81%、33.71%是一种优质的中甘氨酸的含量最高（7.87%），盐溶性和不溶性蛋白中含量为 15.65%、8.64%。方格星虫因特有的鲜美备受人们的青睐成蛋白中呈味氨基酸占总氨基酸的 50%，因此方格星虫的鲜关[78]。研究表明活性肽与氨基酸序列有密切关系，活性肽末水氨基酸时候，该活性肽的免疫活性较好[79]。方格星虫的酸和疏水性氨基酸占总氨基酸的 52.22%、54.11%和 52.18成蛋白中可能存在具有免疫活性的物质。虫蛋白质组分分子量分布

交互作用,显著性结果,稳定点,加酶量

22图 3-3 各因素交互作用对脾淋巴细胞增殖能力的影响ig.3-3 The effect of the interaction of various factors on the proliferative capacity of splymphocyte由图 3-3 可知 4 个因素的 6 个交互作用稳定点均在实验范围以内，由加酶的交互作用图形可知，曲面弯曲较大，等高线形状接近椭圆[90]，因此加酶的交互作用优于其他因素组分，此结论与表 3-5 中显著性结果一致。Dert 对于实验的优化结果为：液料比（v/m）5.22:1、时间 4.60 h、加酶量 24

肽链,离子,二级质谱,质谱分析

裸体方格星虫活性肽的酶法制备及其免疫活性的研究组分进行下一步的质谱分析。质谱分析质谱分析是检测多肽氨基酸序列的最常用方法之一。在检测过程中，首先质谱图内找到肽段的母离子才能进行二级质谱测定；在二级质谱测定过程受到惰性气体的碰撞分裂成不同质量分数的离子碎片；最后根据二级质谱子推测氨基酸序列，二级质谱中的碎片离子只要有卫星离子、序列离子、离子、侧链脱水离子和脱氨离子等[118]，因此可以从碎片离子的状态推测多酸序列的信息，一般情况下，多肽的断裂规律如图 5-14 所示，由于多肽链很容易断裂，所以更容易出现 b 型和 y 型离子[119]。

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