具有抗氧化、抗衰老活性的多肽筛

发布时间：2020-10-29 19:20

　　 随着我国乃至世界人口老龄化的加剧,衰老带来的一系列健康、医疗和社会问题已逐渐突显出来。衰老与自由基导致的氧化应激损伤存在密切的联系。因此,研究并发现具有抗氧化和抗衰老的功能物质是应对衰老及其相关疾病的重要途径。生物活性肽大都具备对人体有益的生物学特性,且具有易吸收、生物利用度高和显著的生物学功能的优点,是极具发展前景的功能因子。大豆分离蛋白和海参蛋白分别是植物和动物蛋白中的典型代表,具有丰富且合理的氨基酸组成,是生物活性肽的优质母蛋白。本文以大豆分离蛋白和两种海参为原料进行酶解,旨在探究它们的蛋白酶解物的抗衰老活性,并筛选出具有较强抗衰老活性的酶解物做进一步分离纯化,鉴定结构,并通过氧化损伤模型验证鉴定多肽的抗氧化能力。选用碱性蛋白酶水解两种品种的海参蛋白,得到两种海参酶解物HP-1、HP-2,蛋白回收率分别为37.19±2.03%、30.13±1.68%;用碱性蛋白酶和复合风味蛋白酶(3:1)水解大豆分离蛋白,得到大豆分离蛋白酶解物SP,蛋白平均回收率为42.31±2.04%。然后以D-半乳糖诱导的衰老小鼠为模型,通过行为学和相关生化指标来评价这三种酶解物的延缓衰老功效。实验结果显示,HP-1、HP-2和SP均能在一定程度上延缓小鼠衰老,改善其学习记忆能力,其中SP的效果最佳。在穿梭箱实验,服用SP的小鼠被总电击时间(34.21±6.71s)等指标相比于模型组(53.98±7.97s)都有显著回稳,且趋于正常组(37.75±6.67s)。在水迷宫实验中,服用SP的小鼠的潜伏期(14.26±3.35s)等指标相比于模型组(35.40±9.28s)都有回稳,甚至少于正常组(19.83±7.14s)。另外,相关生化指标检测结果表明,服用三种酶解物能有效稳定机体内SOD、MDA、GSH-Px、AGEs等因子的水平趋于正常组。同样的,SP拥有最显著的效果。综合结果说明三种酶解物的抗衰老活性大小是SPHP-2HP-1,故选着SP进行进一步分析。通过对还原力、羟自由基清除率、DPPH·清除率三种体外抗氧化模型筛选,发现三种酶解物的DPPH·清除率活性顺序与动物实验结果一致,即SPHP-2HP-1,故其可作为进一步实验的筛选指标。用DEAE-52分离纯化酶解物SP,得到的三个组分中以fa的DPPH·清除活性最佳,用HPLC法测定fa和SP的分子量分布发现,发现它们的分子量小于1000 Da的占绝大部分,分别为84.26%和80.37%。fa经过Sephadex G-15分离纯化后,选择DPPH·活性最优的组分fd进行UPLC-MS/MS实验。结合数据库分析二级质谱图,最终得到两条大豆多肽WPK、AYLH。通过合成公司合成两条大豆多肽WPK、AYLH,其纯度均在99%以上。毒性实验表明,在一定浓度范围内,这两条多肽对细胞无显著毒性或增殖效果。经过造模实验摸索,选择以0.4 mmol/L H_2O_2为PC12细胞氧化损伤的造模浓度。功效评价实验结果表明,预孵育多肽WPK、AYLH的PC12细胞的存活率相比于没有预孵育多肽的模型组有显著提高,且细胞内ROS水平有明显降低,这就验证了两条多肽对H_2O_2诱导的细胞氧化损伤有很好的保护作用。因此,大豆分离蛋白酶解物及其大豆多肽WPK、AYLH被验证具有显著的抗氧化、抗衰老活性,可作为功能性食品原料,在延缓机体衰老、减少氧化应激损伤等方面有良好的运用前景。
【学位单位】：华南理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.2
【部分图文】：

华南理工大学工程硕士学位论文以预防和推迟的。氧化生大多是由细胞的老化开始，最终影响整个器官的老化。衰老结果，现在普遍认为其与自由基、基因、激素等因素有关，然的机制尚未彻底搞清楚[2]。目前，许多学者都提出了有关衰老自由基理论、端粒学说、基因衰老学说、遗传程序学说等，其认同[8]。

第二章 三种蛋白酶解物的抗衰老活性评价及筛选验方法种酶解物的制备参酶解物的制备选用两种海参形状如下图 2-1 所示，使用碱性蛋白酶在最适温度 55℃下种海参，料液比 1:4，酶解 4 小时，加酶量约为 0.2g 每 100g 干重海参 左右。酶解结束后，在 8000r/min、4℃的离心条件，离心 20min 分离得冻干即得海参酶解物，养殖海参酶解物命名为 HP-1，野生海酶解物参白含量检测方法参考 GB 5009.4-2010《食品中蛋白质的测定》。

图 2-2 小鼠穿梭实验结果。（a）不同组别的总电击时间比较 （b）不同组别的电击次数比较 （c）不同组别的主动逃避次数比较 （d）不同组别的主动逃避时间比较；与正常组相比：#p<0.05，##p<0.01；与模型组相比：*p<0.05，**p<0.01；Fig 2-2 The results of shuttle box experiment. (a) Comparison of total shock time indifferent groups. (b) Comparison of the number of shocks in different groups. (c) Comparisonof active escape times in different groups. (d) Comparison of active escape time in differentgroups.#p<0.05,##p<0.01 versus the control mice. *p<0.05, **p<0.01 versus the modelgroup mice.2.4.2.2 Morris 水迷宫实验结果与讨论Morris 水迷宫是英国心理学家 Morris 于 20 世纪 80 年(1981)代初设计并应用于脑学习记忆机制研究的一种实验手段，是一种强迫实验动物(大鼠、小鼠)游泳，学习寻找隐藏在水中平台的一种实验，主要用于测试实验动物对空间位置觉和方向觉(空间定位)的
【参考文献】

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本文编号：2861339