美拉德反应影响拟穴青蟹主要过敏原致敏性的机理研究

发布时间：2020-11-01 03:30

　　 拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国广受消费者喜爱的水产品之一。近年来对拟穴青蟹过敏的患者日益增多,因此本文以拟穴青蟹为实验对象,针对其主要过敏原原肌球蛋白(tropomyosin,TM)和精氨酸激酶(arginine kinase,AK),采用L-阿拉伯糖进行美拉德反应处理,通过细胞模型、BALB/c小鼠实验模型等方法进行分析。本研究首先采用IEDB在线软件预测拟穴青蟹TM和AK的T细胞表位,TM的T细胞表位分布在M_1-Q_(27)、E_(37)-L_(57)、E_(103)-R_(127)等8个区域,AK的T细胞表位分布在E_(18)-L_(50)、D_(62)-K_(98)、F_(104)-G_(133)等8个区域。表位信息的补全为后续食品加工实验奠定理论基础。然后建立TM和AK与L-阿拉伯糖的美拉德反应体系(过敏原:阿拉伯糖=1:3,W/W,100℃加热60 min,pH 8.5)。Western blot和Dot blot的分析结果显示美拉德反应产物的IgG和IgE免疫结合活性均显著降低,且TM和AK的美拉德反应产物刺激RBL-2H3细胞后脱颗粒的释放率分别降低了15.9%和33.5%。通过圆二色谱分析发现TM的美拉德反应产物(MR-TM)的二级结构未见显著变化,但AK的美拉德反应产物(MR-AK)的α-螺旋含量显著降低14.8%。小鼠敏化实验发现美拉德反应产物显著降低Th2型细胞因子IL-4和IL-13的释放水平,而Th1型细胞因子INF-γ的释放水平显著升高。通过LC-MS/MS检测糖化位点,发现MR-TM的T细胞表位上的R_(125)、R_(152)、K_(161)等和B细胞表位上的K_(49)、R_(90)、K_(112)等发生糖化修饰;MR-AK的T细胞表位上的K_(33)、K_(40)、R_(129)等和B细胞表位上的K_(33)、K_(43)、R_(202)等发生糖化修饰,同时发现C_(139)、M_(173)、C_(201)等发生氧化修饰。最后通过树突状细胞(Dendritic cell,DC)模型分析验证美拉德反应产物的免疫原性,结果发现美拉德反应产物会抑制细胞表面受体CD86的表达水平,回调抑制调控因子H2-Ob,抑制DC向CD4~+T细胞递呈抗原肽的功能。小鼠耐受诱导模型分析结果显示,由于MR-AK的B细胞表位被破坏,在不引起过敏症状的情况下,致敏性显著降低的MR-AK少量多次的进入机体后能激活调节性T细胞,促使其产生转化生长因子-β(TGF-β)和IL-10而调节Th2/Th1的平衡,同时抑制血清中特异性IgE抗体和组胺水平。并设计研发了一种低致敏性蟹钳产品,通过动物实验验证了产品中TM的致敏性显著降低。综上所述,本研究建立了消减TM和AK致敏性的美拉德反应体系;通过质谱鉴定发现美拉德反应产物的T细胞表位和B细胞表位均发生糖化修饰,影响美拉德反应产物的免疫原性,从而降低DC细胞对美拉德反应产物的递呈效果,且通过小鼠实验发现MR-AK具有诱导免疫耐受的潜力。并依据这些理论研究进一步研发一种低致敏性蟹钳产品。
【学位单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS254.1
【部分图文】：

gen Epitope）决定的，其表位分为 T 细胞表位和 B 细胞表位[14]。T 细容性复合体（Major Histocompatibility Complex，MHC）密切相关，MI 型和 MHC-II 型，过敏反应与 MHC-II 型有关[15]。人类的 MHC 产物通常被称为 HLA（Human leukocyte antigen，HLA），小鼠的 MHmpatibility antigen-2，H-2）[16]。敏相关的辅助 T 细胞不能直接识别过敏原，仅能识别树突状细胞原肽复合物[17]1166。食物过敏原进入机体后，通常是被小肠外周组织endritic Cell，DC）所摄取，然后被 DC 内的溶酶体所酶解，经过酶解在高尔基体内与 MHC-II 融合形成复合物，然后被转运、表达于 DC 肽就是过敏原的 T 细胞表位。如图 1-1 所示，在 DC 表面的抗原肽-M会被 T 细胞表面受体（T Cell Receptor，TCR）所识别，然后 T 细胞会分辅助 T 细胞[14]，并分泌白细胞介素 4（Interleukins 4，IL-4）和白细kins 13，IL-13），从而调控 B 细胞分化成 IgE 分泌型的浆细胞，大量产E 特异性识别的过敏原的特征部位称为 B 细胞表位，分为氨基酸序列基酸位置不连续但在折叠之后空间相邻的构象型表位[21]。

图 1-2 过敏原特异性免疫治疗机理Fig.1-2 Mechanism of allergen-specific immunotherapy本图考参 Tordesillas 等的研究绘制[4, 44, 79-81]的与意义Scylla Paramamosain）在动物分类中属于节肢动物门，喜带、红树林等盐度稍低的泥沼或沟壑中[85]。据《中国渔业统的海水养殖总产量达 151976 吨，全国海洋捕捞产量 7949价值丰富闻名，随着消费量的逐年增多，引发的食物过敏病工技术和生物技术的提高，人们对食物过敏原理化性质和用食品加工技术降低过敏原致敏性的研究越来越受到社会有一项拥有自主知识产权的脱敏食品上市，因此，脱敏技现出强大的潜力，本实验致力于应用美拉德反应技术研发国低过敏食品产业的发展。本实验室前期针对蟹类主要过

图 3-1 青蟹 TM 的 SDS-PAGE 和 Western blot 分Fig. 3-1 SDS-PAGE and Western blot analysis of TTM 的 SDS-PAGE 分析；B：TM 的 Western bloM：标准蛋白；TM：原肌球蛋白鉴定肌浆蛋白，再经硫酸铵盐析、阴离子交换40 kDa。并通过 Western blot 验证能与兔抗)。
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本文编号：2864971