质子化诱导调控黑芸豆凝集素蛋白致敏性的构效关系研究
发布时间：2020-11-10 12:28
本试验采用质子化诱导处理黑芸豆(Phaseolus vulgaris L.)凝集素,将凝集素置于低于等电点(pI)的系列低pH环境中,对其进行质子化诱导,研究了凝集素结构变化与致敏性消减的构效关系,并进一步探究了质子化诱导处理后,溶液体系回调中性,对芸豆分离蛋白品质的影响。1、同源模建出芸豆凝集素的三维结构,采用多种生物信息学工具预测出B和T细胞抗原表位,进一步通过酶联免疫吸附试验(ELISA)、淋巴细胞增殖和细胞因子释放试验,对抗原表位进行体外验证,发现4个B细胞抗原表位(B1:NVNDNGEPTLSS、B2:VGSEPKDKGG、B3:NNYKYDSNAHT和B4:LYNVHWDPKPRH)和2个T细胞表位(T1:LQRDATVSS和T2:FNIDVPNNS),高疏水性正电荷性质的氨基酸残基在凝集素抗原表位构成中发挥重要作用。2、对芸豆凝集素进行质子化诱导处理,研究发现,凝集素结构在不同质子化条件,呈现逐渐展开的过程,并在8 h达到稳定状态。基于内/外源荧光光谱、SDS-PAGE、动态光散射(DLS)、分子排阻色谱(SEC)和差示扫描量热法(DSC)分析发现,质子化诱导可引起凝集素结构去折叠,甚至解聚,可能会掩埋、破坏或分裂凝集素表面抗原表位,并导致更多的凝集素胰蛋白酶酶切位点暴露。3、质子化诱导处理的芸豆凝集素与弗氏完全佐剂(CFA)混合乳化,连续腹腔注射致敏BALB/c小鼠5周,末次通过灌胃大剂量激发致敏。相对于Native组,经处理后的凝集素致敏的BALB/c小鼠致敏症状减轻、免疫球蛋白(IgE和IgG_1)、mMCPT-1、组胺和细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ)含量均显著降低。圆二色谱(CD)、傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和分子动学(MD)模拟表明,质子化诱导可使凝集素α-螺旋含量显著降低,β-折叠含量升高,凝集素蛋白结构去折叠,更多的胰蛋白酶酶切位点暴露于蛋白表面。4、黑芸豆分离蛋白经质子化诱导处理8 h后,回调pH至中性(即质子化诱导还原处理),经冷冻干燥,得到芸豆蛋白粉。结构分析表明,经处理后的分离蛋白α-螺旋含量降低,β-折叠升高,分离蛋白结构解折叠,更多的疏水性氨基酸暴露,总-SH和游离-SH含量显著减少,二硫键(-S-S-)含量增加。功能性研究发现,处理后的分离蛋白,具有更高的乳化性(EAI)和乳化稳定性(ESI)、起泡性(FC)和起泡稳定性(FS)、持油性(FHC)及凝胶性,而溶解性和持水性(WHC)降低。处理后的芸豆蛋白粉凝血活性和致敏性显著性降低,体外消化率明显改善。
【学位单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.21
【部分图文】：
已确定结构的外源凝集素数量急剧增加。特别地是，随着蛋白质组学及分子生物学的发展进步，人们对植物凝集素的研究层次不仅只停留在其简单的生物活性水平上的了解，而是将其延伸到凝集素蛋白分子空间结构水平上。迄今，已通过质谱、核磁、X 射线晶体衍射、表面等离子共振和计算机模拟等技术手段确定了几十种植物凝集素的结构[2, 5, 6]，显著推动了凝集素领域的研究进展，并为蛋白质—碳水化合物相互作用及特异性结合专一性的研究提供结构基础[7]。豆科植物凝集素，是种类最丰富，也是研究最彻底的凝集素家族，其几乎均是从植物种子中分离出来。目前，豆科植物凝集素 PHA-E、PHA-L、ConA、大豆凝集素（SBA）、豌豆凝集素（PSA）和花生凝集素（PNA）等在内的多种凝集素结构已通过核磁及晶体学方法被测定，蛋白质晶体结构数据库中已有超过 200 种豆科植物凝集素结构[5, 8]。从已获得的植物凝集素晶体结构表明：植物凝集素的一级、二级及空间结构均较相似。这些凝集素多由2个或4个相同或几乎相同的25~3kDa 的亚基组成，其中，每个亚基含有一个糖结合位点和两个金属离子（钙和锰离子）结合位点，为金属离子结合的糖蛋白，具有独立特异性结合糖的能力[2, 9, 10]红芸豆凝集素（PHA-E）的晶体结构如图 1.1 所示。
[21]。图1.2 植物凝集素机体中消化降解的可能机制（摘自Kumar 等[20]）Fig. 1.2 Possible mechanism of digestive degradation in lectins (Kumar et. al.[20])凝集素过敏反应，主要由免疫球蛋白 IgE 介导的免疫应答反应，同时也存在非 IgE 介导的免疫反应，例如：IgE 和 IgG 共同介导的过敏反应或免疫复合物介导的免疫反应[20]。图 1.2 为植物凝集素过敏反应机制途径，其致敏机制可分为两个阶段：凝集素过敏原初次接触和凝集素过敏原二次接触阶段。机体初次接触凝集素过敏原后，过敏原以 MHC II-抗原肽复合物的形式，由抗原呈递细胞（主要是树突细胞）处理和呈递。然后，抗原表位肽被特异性 T 细胞受体（TCR）上的初始 CD4+T 细胞所识别
23]。图1.3 植物凝集素过敏原诱发过敏反应的机制途径（摘自Kumar 等[20]）Fig 1.3 Possible mechanism of allergenicity induced by lectin allergens (Kumar et. al.[20])综上所述，致敏反应是机体对外来过敏原的直接免疫反应，且主要由 IgE 抗体介导。近几十年来，过敏性疾病的发病率逐渐增加，进一步阐明致敏反应的发病机制及过敏反应的分子基础具有重要意义。1.2.2 抗原表位抗原表位，又称抗原决定簇，是指抗原蛋白分子表面具有特殊结构和免疫活性的区域。目前普遍认为，在机体的免疫反应过程中，免疫细胞通常难以借助其表面受体识别整个过敏原蛋白质分子，而仅能识别抗原蛋白质分子上的一段氨基酸序列，也就是说抗体的特异性是针对抗原表位，而不是针对完整的抗原分子[24]。过敏原蛋白的免疫原性，主要由其抗原表位决定，即由抗体识别的蛋白质部分，按与抗原受体结合细胞的不同
【参考文献】
本文编号：2877928
【学位单位】：合肥工业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.21
【部分图文】：
已确定结构的外源凝集素数量急剧增加。特别地是，随着蛋白质组学及分子生物学的发展进步，人们对植物凝集素的研究层次不仅只停留在其简单的生物活性水平上的了解，而是将其延伸到凝集素蛋白分子空间结构水平上。迄今，已通过质谱、核磁、X 射线晶体衍射、表面等离子共振和计算机模拟等技术手段确定了几十种植物凝集素的结构[2, 5, 6]，显著推动了凝集素领域的研究进展，并为蛋白质—碳水化合物相互作用及特异性结合专一性的研究提供结构基础[7]。豆科植物凝集素，是种类最丰富，也是研究最彻底的凝集素家族，其几乎均是从植物种子中分离出来。目前，豆科植物凝集素 PHA-E、PHA-L、ConA、大豆凝集素（SBA）、豌豆凝集素（PSA）和花生凝集素（PNA）等在内的多种凝集素结构已通过核磁及晶体学方法被测定，蛋白质晶体结构数据库中已有超过 200 种豆科植物凝集素结构[5, 8]。从已获得的植物凝集素晶体结构表明：植物凝集素的一级、二级及空间结构均较相似。这些凝集素多由2个或4个相同或几乎相同的25~3kDa 的亚基组成，其中，每个亚基含有一个糖结合位点和两个金属离子（钙和锰离子）结合位点，为金属离子结合的糖蛋白，具有独立特异性结合糖的能力[2, 9, 10]红芸豆凝集素（PHA-E）的晶体结构如图 1.1 所示。
[21]。图1.2 植物凝集素机体中消化降解的可能机制（摘自Kumar 等[20]）Fig. 1.2 Possible mechanism of digestive degradation in lectins (Kumar et. al.[20])凝集素过敏反应，主要由免疫球蛋白 IgE 介导的免疫应答反应，同时也存在非 IgE 介导的免疫反应，例如：IgE 和 IgG 共同介导的过敏反应或免疫复合物介导的免疫反应[20]。图 1.2 为植物凝集素过敏反应机制途径，其致敏机制可分为两个阶段：凝集素过敏原初次接触和凝集素过敏原二次接触阶段。机体初次接触凝集素过敏原后，过敏原以 MHC II-抗原肽复合物的形式，由抗原呈递细胞（主要是树突细胞）处理和呈递。然后，抗原表位肽被特异性 T 细胞受体（TCR）上的初始 CD4+T 细胞所识别
23]。图1.3 植物凝集素过敏原诱发过敏反应的机制途径（摘自Kumar 等[20]）Fig 1.3 Possible mechanism of allergenicity induced by lectin allergens (Kumar et. al.[20])综上所述，致敏反应是机体对外来过敏原的直接免疫反应，且主要由 IgE 抗体介导。近几十年来，过敏性疾病的发病率逐渐增加，进一步阐明致敏反应的发病机制及过敏反应的分子基础具有重要意义。1.2.2 抗原表位抗原表位，又称抗原决定簇，是指抗原蛋白分子表面具有特殊结构和免疫活性的区域。目前普遍认为，在机体的免疫反应过程中，免疫细胞通常难以借助其表面受体识别整个过敏原蛋白质分子，而仅能识别抗原蛋白质分子上的一段氨基酸序列，也就是说抗体的特异性是针对抗原表位，而不是针对完整的抗原分子[24]。过敏原蛋白的免疫原性，主要由其抗原表位决定，即由抗体识别的蛋白质部分，按与抗原受体结合细胞的不同
【参考文献】
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8 姚玉静;杨晓泉;邱礼平;张新会;;食品蛋白质化学改性研究进展[J];粮食与油脂;2006年07期
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1 何述栋;黑芸豆凝集素的纯化和生物信息学及结构与功能特性研究[D];哈尔滨工业大学;2015年
本文编号：2877928
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