基于适配体的食品中抗生素残留分析

发布时间：2020-11-23 16:17

　　 抗生素在动物源食品中的残留会通过食物链进入人体,当人体摄入含有抗生素残留的食物,会造成抗生素的体内积累,从而产生药毒性和抗药性,对人体的健康带来威胁。由于样品基质复杂,目前食品中抗生素残留的定量检测仍面临巨大挑战。因此,迫切需要发展高效的样品前处理技术,建立高选择性和高灵敏度的抗生素残留分离/富集和分析方法。磁性固相萃取作为固相萃取的一种新型模式,具有操作简便、富集效率高、成本低、有机溶剂消耗少等优点,是样品前处理领域极具活力的预富集技术之一。核酸适配体是一类新型的识别分子,由一小段寡核苷酸通过分子内碱基堆积、疏水作用、氢键和静电作用折叠形成独特的三维结构(如发夹、假结、凸环、G-四链体等),从而特异性地识别靶分子。与抗体相比,核酸适配体具有分子量小、稳定性好、易修饰、能可逆变性与复性等优势。目前,适配体已用于多种检测方法,包括比色法、荧光法、电化学法等,其中荧光法因其检测限低,选择性高,信号响应快等优点,而受到广泛关注。目前已经开发了多种基于适配体的荧光分析法,但是大部分需要对适配体进行修饰,此过程耗时,价格昂贵,且修饰的荧光基团(或猝灭基团)可能会影响适配体的亲和力和特异性。因此,开发简单,灵敏,快速的适配体非标记型荧光分析法具有重要意义。三螺旋DNA分子开关由信号转导探针和非标记适配体序列组成,是通过Watson-Crick和Hoogsteen碱基互补配对原理,形成的一种特殊结构。该结构具有通用性好、稳定性强的结构优势。DNA插入型染料是非标记荧光分析法中最为常见的信号转导分子,其单独存在于水溶液中时荧光强度极弱;当其嵌入DNA结构中时,荧光强度显著增强。硫黄素T是一种可诱导富含G的寡核苷酸序列形成G-四链体结构的染料,其具有成本低,水溶性好,背景信号低和使用简单等优点。本文在前人工作的基础上,将适配体高特异性和高亲和性的特点与磁性固相萃取富集效率高、环境友好等优点相结合,制备了一种基于适配体的磁性固相萃取吸附剂,将其用于选择性富集氯霉素,结合高效液相色谱技术,实现了食品中氯霉素残留的高效富集和灵敏检测;基于三螺旋DNA分子开关以及染料硫黄素T,分别建立了两种基于适配体的荧光分析法,用于食品中氯霉素和卡那霉素的选择性检测。具体内容如下:(1)合成了基于适配体功能化的四氧化三铁/氧化石墨烯(Fe_3O_4/GO/Apt)材料,并将其作为磁性固相萃取吸附剂,用于氯霉素的选择性富集,结合高效液相色谱技术,实现了氯霉素的选择性富集和检测。采用改进的Hummers法合成氧化石墨烯,然后通过化学沉淀法合成Fe_3O_4/GO复合材料,最后将适配体通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)共价连接到Fe_3O_4/GO复合材料表面,制得Fe_3O_4/GO/Apt。研究了pH,萃取时间,萃取温度,洗脱剂的种类和体积以及洗脱时间等条件对萃取效率的影响。在最优条件(pH为7.0,萃取时间为5 h,萃取温度为25℃,洗脱剂为甲醇,洗脱剂体积为1.0 mL,洗脱时间为6 min)下,氯霉素浓度和峰面积之间呈现良好的线性关系,线性范围为7.0-1.0×10~3μg L~(-1),相关系数为0.9994,检出限和定量限分别为0.24μg L~(-1)和0.79μg L~(-1)。将建立的方法用于蜂蜜和牛奶样品中氯霉素的分析检测,回收率分别在85.5%-105.0%之间以及80.5%-101.0%之间,相对标准偏差分别低于8.6%和8.9%。(2)构建了基于核酸适配体的三螺旋DNA分子开关(Triple helix molecular switch,THMS),结合荧光分析法,用于氯霉素的检测。THMS主要由信号转导探针(signal transduction probe,STP,两端分别修饰了荧光基团和猝灭基团的一小段碱基序列)和适配体组成。当STP单独存在时,由于其两端修饰的荧光基团与猝灭基团相互靠近,会发生荧光共振能量转移,导致荧光猝灭,此时体系的荧光强度极弱;当加入适配体之后,适配体会与STP之间通过Watson-Crick和Hoogsteen碱基配对原理形成THMS结构,此时STP的荧光基团和猝灭基团彼此远离,使得荧光恢复,体系荧光强度显著增强;当加入目标物氯霉素后,适配体会特异性识别氯霉素并与之结合,THMS结构遭到破坏,STP被释放并游离出来,体系荧光强度降低。基于上述原理,研究了适配体臂段长度,缓冲液pH和Mg~(2+)浓度以及THMS形成时间等因素对荧光强度和荧光猝灭效率的影响。在最优条件(适配体臂段为9个碱基,pH为6.5,Mg~(2+)浓度为2.5 mmol L~(-1),THMS形成时间为30 min)下,氯霉素浓度和荧光猝灭量之间呈现良好的线性关系,线性范围为5.0-2.0×10~2 nmol L~(-1),相关系数为0.9963,检出限为1.2 nmol L~(-1)。将该方法用于蜂蜜样品中氯霉素的分析检测,回收率在84.5%-103.0%之间,相对标准偏差低于4.6%。该方法结合了三螺旋DNA分子开关通用性、稳定性好的结构优势以及核酸适配体良好的特异性,使其在抗生素分析检测方面具有良好的应用前景。(3)基于核酸适配体和硫黄素-T(Thioflavin T,ThT),构建了一种非标记型荧光适配体传感器用于卡那霉素的分析检测。当ThT单独存在于水溶液中时,体系的荧光强度极弱;当加入适配体(富含G碱基的单链DNA,易形成G-四链体构型)后,ThT会插入适配体结构中,使得体系荧光强度显著增强。当加入目标物卡那霉素后,适配体会特异性识别卡那霉素并与之结合,ThT被释放,体系荧光强度显著降低。基于上述实验原理,研究了反应介质,适配体浓度,ThT浓度以及适配体与ThT之间的反应时间等因素对荧光强度和荧光猝灭效率的影响。在最优条件(反应介质为超纯水,适配体浓度为0.5μmol L~(-1),ThT为2.0μmol L~(-1),适配体与ThT反应时间为20 min)下,卡那霉素浓度的对数与荧光猝灭量之间呈现良好的线性关系,线性范围在5.0×10~(-2)-2.0×10μmol L~(-1)之间,相关系数可以达到0.9919,检出限为0.01μmol L~(-1)。将该方法用于牛奶样品中卡那霉素的检测,回收率在85.4%-105.4%之间,相对标准偏差小于5.7%。
【学位单位】：浙江师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：O657.3;TS207.5
【部分图文】：

图 1.1 适配体的筛选过程酸适配体的特点体对目标物具有特异性，因此也被称作“化学抗体”[50]。与很多优势[51-55]，这些优势使其具有广阔的应用前景。）不依赖生物体，可体外筛选，易人工合成。随着 SELEX 技适配体的筛选速度越来越快。）靶标分子种类多。适配体的靶分子有抗生素，多肽，氨基酸理论上讲，只要寡核苷酸文库足够大，可以通过 SELEX 技术质的适配体。）特异性高。核酸适配体是经过多次严格筛选获得的，与靶标可以识别细微变化。）热稳定性好，有利于保存和运输。

.1 β-内酰胺类1.1 氨苄西林青霉素抗性菌株的出现促使人们寻找新的抗生素，从中发现了半合成的如氨苄西林。该抗生素是一种广泛用于兽医学的广谱抗生素[82]。Luo金纳米粒子修饰的磁珠复合物（AuNPs/MBs）和切口酶开发了一种用苄西林的荧光适配体传感器（图 1.2）。在聚乙烯亚胺（PEI）存在下合Ps/MBs，其具有优异的磁分离性能和强大的共价生物结合能力。在氨在下，氨苄西林和适配体之间的特异性结合，导致适配体的部分互DNA）释放，释放的 cDNA 启动切口酶辅助信号放大（NEASA）循环。下该方法的线性范围为 0.1 - 100 ng mL-1，检测限为 0.07 ng mL-1。此外体传感器还成功用于实际样品中氨苄西林的检测。

图 1.3 新型电化学适配体传感器用于检测青霉素的示意图氨基糖苷类卡那霉素ang 等[85]开发了一种基于液晶的适配体传感器用于测定卡那霉素（霉素适配体与 N，N-二甲基-N-（3-（三甲氧基甲硅烷基）丙基）氰化物（DMOAP）一起固定在载玻片上，此时液晶膜的取向垂直霉素时，适配体会与卡那霉素结合，破坏液晶的定向排列，从而导粉红色变为绿色。该方法具有较高的特异性，检出限低至 1 nmo于实验室的卡那霉素分析方法不同，该方法不需要仪器读数，在现测方面非常有益。
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本文编号：2894766