荞麦胰蛋白酶抑制剂亲和材料的制备及应用
发布时间：2021-06-26 12:30
亲和层析具有特异性强、高效、操作简单等多种优势,是纯化生物酶的首选方法。荞麦胰蛋白酶抑制剂（Buckwheat trypsin inhibitor,BTI）是一种胰蛋白酶的竞争型抑制剂。BTI良好的热稳定性和酸碱稳定性及对胰蛋白酶较强的抑制作用能满足亲和材料制备对配基的要求,因而能够用于制备亲和层析介质,实现一步层析得到高纯度胰蛋白酶的目的,为今后大规模制备胰蛋白酶及开发新型胰蛋白酶提供重要的理论依据。第一部分:基于抑制剂与酶的特异亲和作用,将具有良好稳定性的BTI固定化,制备成一种新型胰蛋白酶的亲和材料,用于胰蛋白酶的高效纯化。通过原核表达、Ni2+-NTA亲和层析和Superdex G-25凝胶过滤层析等方法获得电泳纯的重组BTI。以Sepharose为载体,BTI为配基,比较三种活化载体方法（溴化氢,环氧氯丙烷,羰基二咪唑）,选出制备BTI-Sephorose亲和材料的最优活化方法。结果表明,BTI的耐热性、良好的酸碱稳定性和对胰蛋白酶的专一性抑制满足了亲和材料制备对配基的要求。羰基二咪唑是一种比较理想的活化剂,可为亲和层析固定化其他酶提供参考。第二部分:以...
【文章来源】：山西大学山西省
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
BTI的亲和层析分离
第二章荞麦胰蛋白酶抑制剂亲和材料的制备9蛋白变性沉淀，离心后进行Ni2+-NTA亲和层析，结果见图2.1。通过测定各蛋白峰抑制活性，结果显示图2.1中的蛋白峰1和2均无抑制活性，蛋白峰3（含300mmol/L咪唑的洗脱液）抑制胰蛋白酶活性很强，为目的蛋白。以低分子量蛋白质Marker（14.4～97.4kDa）为参照，将经SuperdexG-25脱盐后的BTI进行SDS-PAGE鉴定，结果见图2.2。BTI（泳道1）在电泳图谱上显示单一蛋白条带，表明经纯化所得BTI纯度较高，达到了电泳纯。同时也表明亲和层析是种很高效的纯化方法，仅需一次层析便得到了高纯度的目的蛋白。图2.1BTI的亲和层析分离峰1、2：穿透峰；峰3，洗脱峰（含300mmol/L咪唑的洗脱液）Fig.2.1PurificationofBTIproteinbyNi2+-NTAaffinitychromatographyPeaks1and2wereelutedbybufferincluding20mmol/Limmidazole;Peak3waselutedbybufferincluding300mmol/Limmidazole图2.2BTI的SDS-PAGE电泳图谱泳道1，BTI；泳道2，标准分子量MarkerFig.2.2SDS-PAGEofBTILane1,BTI;Lane2,ProteinMarker
第三章牛胰蛋白酶的亲和纯化17蛋白酶活性。洗脱峰2的出现表明在pH为7.0的平衡缓冲液条件下上样时，胰蛋白酶结合到了BTI-Sepharose上，BTI与胰蛋白酶的活性部位以非共价键相互作用形成类似酶-底物的米氏复合物，在pH3.5缓冲液条件下这种作用力减弱，胰蛋白酶从柱上洗脱下来[44]。洗脱下来的胰蛋白酶在pH3.5时生物活性不变。穿透峰1的出现可能是因为牛胰蛋白酶上样量过大，超过了BTI-Sepharose亲和柱的吸附容量。图3.1胰蛋白酶的亲和层析分离图谱Fig.3PurificationoftrypsinbyaffinitychromatographywithBTI-Sepharosecolumn3.3.3.1pH值对BTI-Sepharose吸附混合物中牛胰蛋白酶的影响降低胰蛋白酶上样量为3mg，将胰蛋白酶与BSA低温混合样品在pH为7.0的平衡缓冲液条件下快速上样于BTI-Sepharose亲和层析柱，pH3.5的缓冲液洗脱，纯化层析结果见图3.2。上样与洗脱时均出现了蛋白峰，表明有一种蛋白在pH7.0缓冲液的条件下未与亲和柱结合，另一种蛋白在此条件与亲和柱结合，但在pH3.5缓冲液条件下与柱解离，被洗脱出来。对两个蛋白峰进行胰蛋白酶活性鉴定，发现穿透峰没有胰蛋白酶活性，而洗脱峰有活性，表明穿透峰为BSA，没有胰蛋白酶，则胰蛋白酶全部结合到亲和柱上。SDS-PAGE图谱（图3.3）显示洗脱样品（泳道2）牛胰蛋白酶为单一条带，穿透峰（泳道1）中只有BSA（BSA为胰蛋白酶的底物，尽管低温混合但BSA还是不可避免被水解），进一步说明BTI-Sepharose柱可以特异结合胰蛋白酶。图3.2胰蛋白酶与BSA在pH7.0平衡条件下的层析图
【参考文献】：
期刊论文
[1]草鲢鳙鲤鲫罗非，粤鄂苏赣湘辽宁：六鱼争辉！中国淡水鱼养殖现状分析[J]. 刘敏,孙广文,王卓铎. 当代水产. 2019(12)
[2]酶制剂在食品中的应用及发展[J]. 李春华. 食品安全导刊. 2019(30)
[3]酶制剂的研究与应用现状[J]. 付建蒙. 农家参谋. 2019(10)
[4]Poloxamer 407-胰蛋白酶混合凝胶提高腺病毒转染移植静脉组织效率的研究[J]. 王小文,李送,钟昌明,张诚,黄春,冯波,吕志前. 中国细胞生物学学报. 2019(03)
[5]基于核酶的自剪切sgRNA及其在基因编辑中的应用[J]. 单策,李中瀚. 四川大学学报(自然科学版). 2019(02)
[6]金属离子对微生物蛋白酶活性的影响及机理[J]. 余茜,张国丽,敖晓琳. 中国食品学报. 2019(04)
[7]胰蛋白酶消化法测定牛胶原蛋白三股螺旋结构的含量[J]. 梁健华,梁杏,李奕恒. 天然产物研究与开发. 2019(08)
[8]改革开放助发展 开创渔业新局面[J]. 卓友瞻. 中国水产. 2019(01)
[9]汽巴蓝F3GA染料亲和色谱介质的制备及其对黑芸豆凝集素的特异性吸附[J]. 赵金龙,李延红,孙汉巨,方利,孙先保,唐明明,张扬,武香玉,何述栋. 食品科学. 2018(23)
[10]双酶法提取星鳗骨鱼油的工艺研究[J]. 薛宇航,刘峰,方旭波,陈小娥. 食品工业. 2018(09)
博士论文
[1]草鱼消化系统蛋白酶生化特性的研究[D]. 刘忠义.江南大学 2007
硕士论文
[1]碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究[D]. 杨丽媛.东北师范大学 2015
[2]免疫亲和柱的制备及其对酪氨酸酶卵黄抗体的纯化[D]. 丁一民.中国海洋大学 2015
[3]日本鳗鲡胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的分离纯化及性质分析[D]. 李辉.集美大学 2015
[4]不同食性鱼类胰蛋白酶的提纯、性质及蛋白消化力的比较研究[D]. 王秋岑.南昌大学 2013
[5]利用血红素亲和层析纯化大肠杆菌血红素结合蛋白的研究[D]. 徐朋朋.暨南大学 2010
[6]鲈鱼胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的分离纯化及性质分析[D]. 蒋誉坤.集美大学 2010
[7]动态高压微射流技术对胰蛋白酶和菠萝蛋白酶性质和构象变化的影响[D]. 张兆琴.南昌大学 2010
[8]鲫鱼肝胰脏中胰蛋白酶和胰凝蛋白酶的分离纯化及性质研究[D]. 杨锋.集美大学 2009
[9]奥尼罗非鱼胰蛋白酶的纯化、性质及蛋白消化力的研究[D]. 丁茜.重庆师范大学 2009
[10]重组人胰岛素在大肠杆菌中表达及分离纯化[D]. 陈阳.北京化工大学 2008
本文编号：3251347
【文章来源】：山西大学山西省
【文章页数】：55 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
BTI的亲和层析分离
第二章荞麦胰蛋白酶抑制剂亲和材料的制备9蛋白变性沉淀，离心后进行Ni2+-NTA亲和层析，结果见图2.1。通过测定各蛋白峰抑制活性，结果显示图2.1中的蛋白峰1和2均无抑制活性，蛋白峰3（含300mmol/L咪唑的洗脱液）抑制胰蛋白酶活性很强，为目的蛋白。以低分子量蛋白质Marker（14.4～97.4kDa）为参照，将经SuperdexG-25脱盐后的BTI进行SDS-PAGE鉴定，结果见图2.2。BTI（泳道1）在电泳图谱上显示单一蛋白条带，表明经纯化所得BTI纯度较高，达到了电泳纯。同时也表明亲和层析是种很高效的纯化方法，仅需一次层析便得到了高纯度的目的蛋白。图2.1BTI的亲和层析分离峰1、2：穿透峰；峰3，洗脱峰（含300mmol/L咪唑的洗脱液）Fig.2.1PurificationofBTIproteinbyNi2+-NTAaffinitychromatographyPeaks1and2wereelutedbybufferincluding20mmol/Limmidazole;Peak3waselutedbybufferincluding300mmol/Limmidazole图2.2BTI的SDS-PAGE电泳图谱泳道1，BTI；泳道2，标准分子量MarkerFig.2.2SDS-PAGEofBTILane1,BTI;Lane2,ProteinMarker
第三章牛胰蛋白酶的亲和纯化17蛋白酶活性。洗脱峰2的出现表明在pH为7.0的平衡缓冲液条件下上样时，胰蛋白酶结合到了BTI-Sepharose上，BTI与胰蛋白酶的活性部位以非共价键相互作用形成类似酶-底物的米氏复合物，在pH3.5缓冲液条件下这种作用力减弱，胰蛋白酶从柱上洗脱下来[44]。洗脱下来的胰蛋白酶在pH3.5时生物活性不变。穿透峰1的出现可能是因为牛胰蛋白酶上样量过大，超过了BTI-Sepharose亲和柱的吸附容量。图3.1胰蛋白酶的亲和层析分离图谱Fig.3PurificationoftrypsinbyaffinitychromatographywithBTI-Sepharosecolumn3.3.3.1pH值对BTI-Sepharose吸附混合物中牛胰蛋白酶的影响降低胰蛋白酶上样量为3mg，将胰蛋白酶与BSA低温混合样品在pH为7.0的平衡缓冲液条件下快速上样于BTI-Sepharose亲和层析柱，pH3.5的缓冲液洗脱，纯化层析结果见图3.2。上样与洗脱时均出现了蛋白峰，表明有一种蛋白在pH7.0缓冲液的条件下未与亲和柱结合，另一种蛋白在此条件与亲和柱结合，但在pH3.5缓冲液条件下与柱解离，被洗脱出来。对两个蛋白峰进行胰蛋白酶活性鉴定，发现穿透峰没有胰蛋白酶活性，而洗脱峰有活性，表明穿透峰为BSA，没有胰蛋白酶，则胰蛋白酶全部结合到亲和柱上。SDS-PAGE图谱（图3.3）显示洗脱样品（泳道2）牛胰蛋白酶为单一条带，穿透峰（泳道1）中只有BSA（BSA为胰蛋白酶的底物，尽管低温混合但BSA还是不可避免被水解），进一步说明BTI-Sepharose柱可以特异结合胰蛋白酶。图3.2胰蛋白酶与BSA在pH7.0平衡条件下的层析图
【参考文献】：
期刊论文
[1]草鲢鳙鲤鲫罗非，粤鄂苏赣湘辽宁：六鱼争辉！中国淡水鱼养殖现状分析[J]. 刘敏,孙广文,王卓铎. 当代水产. 2019(12)
[2]酶制剂在食品中的应用及发展[J]. 李春华. 食品安全导刊. 2019(30)
[3]酶制剂的研究与应用现状[J]. 付建蒙. 农家参谋. 2019(10)
[4]Poloxamer 407-胰蛋白酶混合凝胶提高腺病毒转染移植静脉组织效率的研究[J]. 王小文,李送,钟昌明,张诚,黄春,冯波,吕志前. 中国细胞生物学学报. 2019(03)
[5]基于核酶的自剪切sgRNA及其在基因编辑中的应用[J]. 单策,李中瀚. 四川大学学报(自然科学版). 2019(02)
[6]金属离子对微生物蛋白酶活性的影响及机理[J]. 余茜,张国丽,敖晓琳. 中国食品学报. 2019(04)
[7]胰蛋白酶消化法测定牛胶原蛋白三股螺旋结构的含量[J]. 梁健华,梁杏,李奕恒. 天然产物研究与开发. 2019(08)
[8]改革开放助发展 开创渔业新局面[J]. 卓友瞻. 中国水产. 2019(01)
[9]汽巴蓝F3GA染料亲和色谱介质的制备及其对黑芸豆凝集素的特异性吸附[J]. 赵金龙,李延红,孙汉巨,方利,孙先保,唐明明,张扬,武香玉,何述栋. 食品科学. 2018(23)
[10]双酶法提取星鳗骨鱼油的工艺研究[J]. 薛宇航,刘峰,方旭波,陈小娥. 食品工业. 2018(09)
博士论文
[1]草鱼消化系统蛋白酶生化特性的研究[D]. 刘忠义.江南大学 2007
硕士论文
[1]碱性蛋白酶的分离纯化及其酶学特性的研究[D]. 杨丽媛.东北师范大学 2015
[2]免疫亲和柱的制备及其对酪氨酸酶卵黄抗体的纯化[D]. 丁一民.中国海洋大学 2015
[3]日本鳗鲡胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的分离纯化及性质分析[D]. 李辉.集美大学 2015
[4]不同食性鱼类胰蛋白酶的提纯、性质及蛋白消化力的比较研究[D]. 王秋岑.南昌大学 2013
[5]利用血红素亲和层析纯化大肠杆菌血红素结合蛋白的研究[D]. 徐朋朋.暨南大学 2010
[6]鲈鱼胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶的分离纯化及性质分析[D]. 蒋誉坤.集美大学 2010
[7]动态高压微射流技术对胰蛋白酶和菠萝蛋白酶性质和构象变化的影响[D]. 张兆琴.南昌大学 2010
[8]鲫鱼肝胰脏中胰蛋白酶和胰凝蛋白酶的分离纯化及性质研究[D]. 杨锋.集美大学 2009
[9]奥尼罗非鱼胰蛋白酶的纯化、性质及蛋白消化力的研究[D]. 丁茜.重庆师范大学 2009
[10]重组人胰岛素在大肠杆菌中表达及分离纯化[D]. 陈阳.北京化工大学 2008
本文编号：3251347
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