农产品赭曲霉毒素A核酸扩增检测技术研究
发布时间：2021-08-15 11:58
赭曲霉毒素是一类真菌次生代谢物,主要由曲霉菌属和青霉菌属的某些种产生,其中赭曲霉毒素A（Ochratoxin A,OTA）毒素强,污染广,一旦污染了农产品则很难降解去除。因此,开发具有高灵敏度的检测方法显得尤为重要。近年来,核酸扩增技术拓展应用于真菌毒素检测,并被认为是推动真菌毒素与食源性致病菌同步检测的重要平台。然而,因为真菌毒素是小分子化合物无法直接扩增,所以使得真菌毒素的核酸扩增技术一直难以突破。针对上述难题,本研究以OTA为研究对象,采用实验室前期成功研制出OTA抗独特型纳米抗体噬菌体（phage VHH 2-21）作为研究材料,利用噬菌体展示抗体同时具备抗体和对应DNA的特点,研究探讨并建立了农产品OTA的三种核酸扩增检测方法。本研究具体内容和创新点如下:1.研究建立了农产品OTA的基于SYBR GreenⅠ荧光染料的实时免疫PCR检测方法。本研究以phage VHH 2-21为研究材料,通过棋盘法得出了该批次噬菌体展示抗独特型纳米抗体和作包被抗原的最佳免疫工作浓度。针对噬菌体中该抗独特型纳米抗体的核酸序列设计特异性引物,通过后续的扩增得到的熔解曲线和扩增效率证明其正确性。使...
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
赭曲霉毒素的结构式Figure1.1Chemicalstructureofochratoxins
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论3Kampetal.,2005)。此外，Cavin等研究发现的赭曲霉毒素A诱导Nrf2途径减少而氧化损伤增加的现象(Cavinetal.,2007)和赭曲霉毒素A能增加诱导型一氧化氮酶（iNOs）的表达刺激蛋白质硝化的现象(Cavinetal.,2009)也支撑了氧化应激致癌的推测。图1.2OTA与核苷酸加合物的化学结构式Figure1.2ChemicalstructureofOTAnucleosideadducts1.1.2赭曲霉毒素A的污染情况及限量标准赭曲霉毒素A被认为是全球最重要的食品和饲料污染物之一。通常我们可以在咖啡、葡萄、葡萄酒、大豆、啤酒、干果和坚果、肉制品以及所有种类的谷物和谷物制品中检测出赭曲霉毒素A污染(Taoetal.,2018)。2009年，Chiaz等对突尼斯的谷物和谷物制品检测，发现小麦、大麦、大米和高粱中的赭曲霉毒素A的检出率分别是38%、40%、28%和38%，其平均污染水平高达55、96、44、和117μg/kg(Zaiedetal.,2009)。2000年，Markai等采取了31份来自地中海地区的红酒样品，发现赭曲霉毒素A的检出率为100%，其中72%的样品的毒素含量超过0.1μg/L(Markakietal.,2001)。此外，最近报道表明在，甘草(Chenetal.,2015)和食用色素(Solfrizzoetal.,2015)也检测出含有赭曲霉毒素A。因为赭曲霉毒素A污染存在的广泛性和其分子良好的稳定性，所以除去目标物中含有的赭曲霉毒素A十分困难。1.1.3赭曲霉毒素A的检测技术研究进展由于赭曲霉毒素A在食品和饲料中的广泛存在，只有通过检测方法及时的监控才能最大程度的降低赭曲霉毒素A对人和动物健康的影响。为了满足赭曲霉毒素A在不同检测条件的需要，国内外的科研学者不仅改进了包括薄层层析色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附分析法在内的常规检测方法，而且还创新的建立了如生物传感器法、核酸扩增检测等新型方法。1.1.4.1赭?
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论6图1.3抗体结构对比。a.常规IgG抗体，b.重链单域抗体，c.纳米抗体。Figure1.3Structurecomparisonofantibodies.a.conventionalantibody,b.heavychainantibody,c.nanobody.IgG识别抗原能力通过重链（VH）和轻链（VL）的N末端可变区域和6个CDR区域的相互作用实现(Schroeder,2010)。而由于轻链的缺失，纳米抗体的抗原识别位点转移到了重链，通过VHH上的3个CDR区域组成(Conrathetal.,2003)。不同于常规抗体的CDR区域通常形成平坦或者凹入的结合位点，纳米抗体的CDR3区较常规抗体长，形成的凸出环使得纳米抗体可以结合许多常规抗体难以结合的抗原位点，例如酶的催化凹槽等(Arbabi-Ghahroudi,2017;Wesolowskietal.,2009)。如图1.4所示，常规抗体保守的框架区（Frameworkregion,FR）中负责VH和VL相互作用功能的4个疏水性氨基酸，在VHH的FR区中被亲水型氨基酸取代，使VHH的溶解性和稳定性得到了增强(Nguyenetal.,2001)。观察VHH的三维空间折叠结构发现，VHH结构域含有9条β链，这些β链通过Cys23和Cys94之间的分子内二硫键形成稳定的结构。源于骆驼的VHH，其CDR3环上的二硫键与CDR1区的连接，源于美洲驼的VHH，其CDR3环上的二硫键与CDR2区的连接，形成进一步稳定VHH的结构(Koenningetal.,2017)。图1.4常规抗体的重链可变区域和纳米抗体对比Figure1.4comparisonbetweenvariableregioninheavychainandVHH1.2.3真菌毒素纳米抗体研发进展随着近年来纳米抗体的应用领域的逐步拓宽，诸多真菌毒素领域的学者将目光聚焦于真菌毒素纳米抗体的开发应用。按照免疫原的不同，纳米抗体可以被分为两类：采用抗原直接免疫得到的特异性纳米抗体；采用针对抗原的特异性抗体免疫得到的抗独特型纳米抗体。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高效液相色谱-串联质谱法测定杂粮豆类中11种真菌毒素[J]. 张新娜,马丽艳,潘赛超,张春娇,张永新,周昉,黄昆仑,戴蕴青. 食品科学. 2019(08)
[2]An overview on application of phage display technique in immunological studies[J]. Abbas Rami,Mahdi Behdani,Najmeh Yardehnavi,Mahdi Habibi-Anbouhi,Fatemeh Kazemi-Lomedasht. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2017(07)
[3]Phi29DNA聚合酶最新应用研究进展[J]. 练杜娟,仇建萍,张平静,朱远源,李谦. 药物生物技术. 2016(02)
[4]高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中的赭曲霉毒素A[J]. 莫瑾,龚强,周慧平,白雪,谭建锡,彭梓,黄迎波. 食品安全质量检测学报. 2016(01)
[5]辅助噬菌体在噬菌体展示中的应用及研究进展[J]. 杜东霞,张冉. 微生物学通报. 2009(02)
博士论文
[1]农产品中黄曲霉毒素新型免疫分析技术研究[D]. 雷佳文.中国农业科学院 2015
[2]噬菌体展示介导的免疫扩增病原检测方法研究[D]. 郭永超.中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
本文编号：3344514
【文章来源】：中国农业科学院北京市
【文章页数】：72 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
赭曲霉毒素的结构式Figure1.1Chemicalstructureofochratoxins
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论3Kampetal.,2005)。此外，Cavin等研究发现的赭曲霉毒素A诱导Nrf2途径减少而氧化损伤增加的现象(Cavinetal.,2007)和赭曲霉毒素A能增加诱导型一氧化氮酶（iNOs）的表达刺激蛋白质硝化的现象(Cavinetal.,2009)也支撑了氧化应激致癌的推测。图1.2OTA与核苷酸加合物的化学结构式Figure1.2ChemicalstructureofOTAnucleosideadducts1.1.2赭曲霉毒素A的污染情况及限量标准赭曲霉毒素A被认为是全球最重要的食品和饲料污染物之一。通常我们可以在咖啡、葡萄、葡萄酒、大豆、啤酒、干果和坚果、肉制品以及所有种类的谷物和谷物制品中检测出赭曲霉毒素A污染(Taoetal.,2018)。2009年，Chiaz等对突尼斯的谷物和谷物制品检测，发现小麦、大麦、大米和高粱中的赭曲霉毒素A的检出率分别是38%、40%、28%和38%，其平均污染水平高达55、96、44、和117μg/kg(Zaiedetal.,2009)。2000年，Markai等采取了31份来自地中海地区的红酒样品，发现赭曲霉毒素A的检出率为100%，其中72%的样品的毒素含量超过0.1μg/L(Markakietal.,2001)。此外，最近报道表明在，甘草(Chenetal.,2015)和食用色素(Solfrizzoetal.,2015)也检测出含有赭曲霉毒素A。因为赭曲霉毒素A污染存在的广泛性和其分子良好的稳定性，所以除去目标物中含有的赭曲霉毒素A十分困难。1.1.3赭曲霉毒素A的检测技术研究进展由于赭曲霉毒素A在食品和饲料中的广泛存在，只有通过检测方法及时的监控才能最大程度的降低赭曲霉毒素A对人和动物健康的影响。为了满足赭曲霉毒素A在不同检测条件的需要，国内外的科研学者不仅改进了包括薄层层析色谱法、高效液相色谱法、酶联免疫吸附分析法在内的常规检测方法，而且还创新的建立了如生物传感器法、核酸扩增检测等新型方法。1.1.4.1赭?
中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论6图1.3抗体结构对比。a.常规IgG抗体，b.重链单域抗体，c.纳米抗体。Figure1.3Structurecomparisonofantibodies.a.conventionalantibody,b.heavychainantibody,c.nanobody.IgG识别抗原能力通过重链（VH）和轻链（VL）的N末端可变区域和6个CDR区域的相互作用实现(Schroeder,2010)。而由于轻链的缺失，纳米抗体的抗原识别位点转移到了重链，通过VHH上的3个CDR区域组成(Conrathetal.,2003)。不同于常规抗体的CDR区域通常形成平坦或者凹入的结合位点，纳米抗体的CDR3区较常规抗体长，形成的凸出环使得纳米抗体可以结合许多常规抗体难以结合的抗原位点，例如酶的催化凹槽等(Arbabi-Ghahroudi,2017;Wesolowskietal.,2009)。如图1.4所示，常规抗体保守的框架区（Frameworkregion,FR）中负责VH和VL相互作用功能的4个疏水性氨基酸，在VHH的FR区中被亲水型氨基酸取代，使VHH的溶解性和稳定性得到了增强(Nguyenetal.,2001)。观察VHH的三维空间折叠结构发现，VHH结构域含有9条β链，这些β链通过Cys23和Cys94之间的分子内二硫键形成稳定的结构。源于骆驼的VHH，其CDR3环上的二硫键与CDR1区的连接，源于美洲驼的VHH，其CDR3环上的二硫键与CDR2区的连接，形成进一步稳定VHH的结构(Koenningetal.,2017)。图1.4常规抗体的重链可变区域和纳米抗体对比Figure1.4comparisonbetweenvariableregioninheavychainandVHH1.2.3真菌毒素纳米抗体研发进展随着近年来纳米抗体的应用领域的逐步拓宽，诸多真菌毒素领域的学者将目光聚焦于真菌毒素纳米抗体的开发应用。按照免疫原的不同，纳米抗体可以被分为两类：采用抗原直接免疫得到的特异性纳米抗体；采用针对抗原的特异性抗体免疫得到的抗独特型纳米抗体。
【参考文献】：
期刊论文
[1]高效液相色谱-串联质谱法测定杂粮豆类中11种真菌毒素[J]. 张新娜,马丽艳,潘赛超,张春娇,张永新,周昉,黄昆仑,戴蕴青. 食品科学. 2019(08)
[2]An overview on application of phage display technique in immunological studies[J]. Abbas Rami,Mahdi Behdani,Najmeh Yardehnavi,Mahdi Habibi-Anbouhi,Fatemeh Kazemi-Lomedasht. Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine. 2017(07)
[3]Phi29DNA聚合酶最新应用研究进展[J]. 练杜娟,仇建萍,张平静,朱远源,李谦. 药物生物技术. 2016(02)
[4]高效液相色谱-串联质谱法检测茶叶中的赭曲霉毒素A[J]. 莫瑾,龚强,周慧平,白雪,谭建锡,彭梓,黄迎波. 食品安全质量检测学报. 2016(01)
[5]辅助噬菌体在噬菌体展示中的应用及研究进展[J]. 杜东霞,张冉. 微生物学通报. 2009(02)
博士论文
[1]农产品中黄曲霉毒素新型免疫分析技术研究[D]. 雷佳文.中国农业科学院 2015
[2]噬菌体展示介导的免疫扩增病原检测方法研究[D]. 郭永超.中国科学院研究生院（武汉病毒研究所） 2007
本文编号：3344514
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