蜡样芽孢杆菌核酸检测方法的研究及其在食品安全评价中的应用

发布时间：2021-09-16 20:06

　　随着人们生活水平的提高以及食品种类的丰富,食品的安全性问题越来越引发人们的关注。蜡样芽孢杆菌是一种存在于自然界中极易引发食物中毒的食源性致病菌,主要能够引起两种食源性疾病,即催吐和腹泻综合症。然而,许多病例可能在临床环境中未被报告或被误诊,因为相关症状通常分别类似于金黄色葡萄球菌中毒（蜡样芽孢杆菌催吐型）或产气荚膜梭菌食物中毒（蜡样芽孢杆菌腹泻型）。因此,发展既快速又准确的现场化检测蜡样芽孢杆菌的手段对于食品安全、疾病预防等相关领域具有十分重要的意义。本论文基于文献和国内外行业发展现状,对蜡样芽胞杆菌核酸检测方法进行梳理,探讨分析其优势与不足,进而建立了两种操作简单、反应快速的核酸检测方法。同时,依据WS/T 82-1996蜡样芽孢杆菌食物中毒诊断标准及处理原则中的要求,对本论文建立的方法进行食品安全评价,主要包括标准达标情况、实用性分析以及应用前景分析等。具体研究内容与结果如下:（1）建立了一种集核酸提取、扩增和检测于一体的蜡样芽孢杆菌检测装置,该装置采用基于变性泡介导的链交换扩增（SEA）原理,仅需巴氏滴管和无需任何修饰的Whatman滤纸就可以实现对蜡样芽孢杆菌的检测。通过加入染... 

【文章来源】：青岛科技大学山东省

【文章页数】：74 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

蜡样芽胞杆菌培养法[11]

和特定病原体诊断提供了广阔的前景。但是核酸杂交技术需要标记昂贵的探针并且操作过程复杂繁琐，增加了检测蜡芽孢杆菌样品的周期，因此不适用于现场快速检测。1.2.4变温核酸扩增方法自1985年发表以来，聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction,PCR）[20]改变了研究和临床实验室进行DNA分析的方式，其原理如图1-2所示。由Cetus的科学家开发的PCR反应通过体外酶促合成数百万个特定DNA片段的拷贝，该反应是在基于两条引物的退火反应和延伸反应的基础上，在DNA变性之后，各引物与两条分开的链发生杂交反应，从而进行延伸。图1-2PCR原理图[20]Figure1-2SchemeofPCRWang等[21]通过使用合成RNA作为内标，开发了一种通过聚合酶链式反应（PCR）定量检测特定mRNA种类的方法。在一个使用相同引物的反应中，特异性扩增了靶标mRNA和内标。然后根据内标生成的标准曲线外推特定mRNA的量。合成内标RNA由多个靶基因上游引物序列的线性阵列组成，然后是其下游引物以相同顺序互补的序列。这种定量PCR方法提供了一种快速而可靠的方法来定量样品中总RNA小于0.1ng的特定mRNA的量。Park等[22]建立了一种可靠、简单且快速的多重PCR方法可同时用于区分和鉴定蜡样芽孢杆菌。使用gyrB和groEL基因作为诊断标记，对蜡样芽孢杆菌组进行特异性和敏感性的鉴定，并且对不同种类的食品样品进行了评估。

蜡样芽孢杆菌核酸检测方法的研究及其在食品安全评价中的应用6图1-3LAMP原理图[25]Figure1-3SchemeofLAMP1.2.5.2依赖于解旋酶的等温核酸扩增美国NewEnglandBiolabs公司在2004年成功研发出了一种依赖于解旋酶的等温核酸扩增技术（HDA）[27]，这个新型等温核酸扩增技术是一种在体外等温环境下通过解旋酶和聚合酶共同作用实现DNA的指数扩增的技术，其原理如图1-4所示。该技术利用解旋酶的解链作用进行反应，然后反应体系中的单链DNA结合蛋白（SSB）能够随机结合单链。同时单链DNA会与其特异性的引物快速进行杂交反应，之后由于DNA聚合酶的存在，能够快速形成双链DNA。但是该方法中所使用的的酶本质上是蛋白质，因此大大提高了检测成本，不适用于现场快速检测。

【参考文献】：
期刊论文
[1]食品中蜡样芽胞杆菌实时荧光RPA检测方法的建立与应用[J]. 刘立兵,南汇珠,孙晓霞,姜彦芬,王金凤,王建昌.  食品科学技术学报. 2018(01)



本文编号：3397210