牛乳中三种主要过敏原双抗夹心ELISA检测方法的建立
发布时间：2021-11-16 23:36
牛乳是人们日常生活中比较普遍的蛋白质来源之一,同时也被WHO认定为人类食物过敏的八大类食品之一。酪蛋白（CN）、β-乳球蛋白（β-LG）和α-乳白蛋白（α-LA）被认为是牛乳中的主要过敏原,目前还没有一个可以有效治疗牛乳过敏的手段。而开展针对乳及乳制品主要过敏原酪蛋白（CN）、β-乳球蛋白（β-LG）和α-乳白蛋白（α-LA）的检测,能够为乳及乳制品过敏原标识标准的建立提供理论支撑和技术支持,也为易感特殊人群的健康提供保障。本论文主要研究了牛乳中三种主要过敏原酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多克隆抗体的制备及性能鉴定、单克隆抗体的制备及性能鉴定、双抗夹心ELISA检测方法的建立及方法学评价。具体研究内容和结果如下:1、酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多克隆抗体的制备及鉴定以牛乳主要过敏原酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白作为免疫抗原,与弗氏佐剂等量混合后,采用颈背部皮下注射的免疫方式对健康的新西兰大白兔进行免疫,制备的兔血清通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法纯化分离后,分别采用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纯度、间接ELISA法测定效价。结果表明,本研究成功制备高纯度抗酪蛋白、α-乳白蛋...
【文章来源】：上海师范大学上海市
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
技术路线图
上海师范大学硕士学位论文第2章CN、α-LA和β-LG兔多克隆抗体的制备及鉴定19图2-1酪蛋白（上）、α-乳白蛋白（中）、β-乳球蛋白（下）四免兔血清效价大白兔在第二次免疫后，进行耳静脉采血（如遇冷天，可进行耳动脉采血），采用间接ELISA方法测定其效价，原则上选择效价高的兔子进行进行兔多克隆抗体血清的收集。由于初次免疫效价较低，从第二次免疫开始分别检测免疫酪蛋
第2章CN、α-LA和β-LG兔多克隆抗体的制备及鉴定上海师范大学硕士学位论文20白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的2只大白兔血清效价，结果见图2-1。从图2-1可以看出，免疫酪蛋白抗原第四次免疫1#兔血清效价最高，可达到1:729000，免疫α-乳白蛋白和β-乳球蛋白抗原第四次免疫后均是2#兔血清效价最高，效价均达到1:729000。2.4.2兔多克隆抗体纯度的测定兔免疫血清经过辛酸-饱和硫酸铵方法纯化后，采用SDS-PAGE凝胶电泳对其进行纯度鉴定，以确定所得到的兔多抗具有较高的纯度。其结果如下图2-2所示，抗酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多抗轻链和重链清晰可见，重链蛋白分子量在50kD左右，说明了抗酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多抗纯度较高。图2-2兔多抗SDS-PAGE电泳结果图（M：低分子量蛋白Marker；1：酪蛋白多抗；2：α-乳白蛋白多抗；3：β-乳球蛋白多抗）2.4.3兔多克隆抗体浓度的测定根据BCA法测蛋白法制作的标准曲线如图2-1所示，标准方程为：y=0.10803x+0.41048，R2=0.99646，通过计算可得酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白多抗浓度如表2-3，可以看出所制备的三种多抗浓度均较高（＞6mg/mL）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于胶体金免疫层析技术对中药材中黄曲霉毒素B1的定量检测研究[J]. 李耀磊,刘丽娜,姚云,赵小旭,周霞,金红宇,马双成. 中国药学杂志. 2019(17)
[2]基于金纳米花标记的免疫层析法检测牛奶中黄曲霉毒素M1[J]. 金玉,刘仁荣,裘雪梅. 食品研究与开发. 2019(13)
[3]胶体金免疫层析法快速测定蜂胶及蜂胶乙醇提取物中氯霉素残留[J]. 周萍,李樱红,尹志红,吕泽田,尹君,王静,徐初. 中国蜂业. 2019(05)
[4]草鱼过敏原蛋白质的分离及其免疫学特性初步鉴定[J]. 陈献雄,邬玉兰,刘志刚. 南昌大学学报(医学版). 2018(01)
[5]动物过敏原牛血清白蛋白间接竞争ELISA检测方法的建立[J]. 朱业培,王玮,吕青骎,钱行,徐幸莲,周光宏. 南京农业大学学报. 2016(02)
[6]牛奶过敏原β-乳球蛋白的单克隆抗体制备及其双抗体夹心法的建立[J]. 陈献雄,邬玉兰,吉琼梅,杨平常,刘志刚. 食品安全质量检测学报. 2015(11)
[7]食品过敏原快速检测技术方法研究进展[J]. 曾颖,蔡玮红. 包装与食品机械. 2015(03)
[8]过敏性疾病患者过敏原检测结果分析[J]. 杨德平. 国际检验医学杂志. 2015(07)
[9]中国312岁儿童自报食物过敏与食物不耐受的相关因素分析[J]. 张雅蓉,陈云,赵艾,李宏亮,母智深,张玉梅,王培玉. 卫生研究. 2015(02)
[10]荧光微球免疫层析法定量检测牛乳中酪蛋白[J]. 杨亚杰,倪小琴,王茜,游琼,张富生,赖卫华. 食品安全质量检测学报. 2014(07)
博士论文
[1]四类重要抗生素残留的免疫快速检测方法的研究[D]. 陈燕妮.江南大学 2017
[2]水产品中三类重要化学残留物快速检测方法的研究[D]. 徐乃丰.江南大学 2015
[3]拟除虫菊酯类农药免疫快速检测方法及其定量构效模型的建立[D]. 陈秀金.江南大学 2013
硕士论文
[1]TGEV单克隆抗体及抗原检测胶体金试纸条的制备[D]. 王一鹏.河北农业大学 2019
[2]澳洲坚果过敏原免疫分析方法的建立与应用[D]. 周柔柔.天津科技大学 2018
[3]金磁酶联免疫法检测牛乳过敏原酪蛋白、α-乳白蛋白的研究[D]. 潘丽.上海师范大学 2016
[4]抗GNA兔单克隆抗体的制备及其夹心ELISA检测体系的建立[D]. 沈金儿.浙江大学 2013
[5]农药2，4-D与通用Ⅱ型拟除虫菊酯完全抗原和多克隆抗体制备[D]. 许啸晨.上海师范大学 2012
本文编号：3499782
【文章来源】：上海师范大学上海市
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
技术路线图
上海师范大学硕士学位论文第2章CN、α-LA和β-LG兔多克隆抗体的制备及鉴定19图2-1酪蛋白（上）、α-乳白蛋白（中）、β-乳球蛋白（下）四免兔血清效价大白兔在第二次免疫后，进行耳静脉采血（如遇冷天，可进行耳动脉采血），采用间接ELISA方法测定其效价，原则上选择效价高的兔子进行进行兔多克隆抗体血清的收集。由于初次免疫效价较低，从第二次免疫开始分别检测免疫酪蛋
第2章CN、α-LA和β-LG兔多克隆抗体的制备及鉴定上海师范大学硕士学位论文20白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的2只大白兔血清效价，结果见图2-1。从图2-1可以看出，免疫酪蛋白抗原第四次免疫1#兔血清效价最高，可达到1:729000，免疫α-乳白蛋白和β-乳球蛋白抗原第四次免疫后均是2#兔血清效价最高，效价均达到1:729000。2.4.2兔多克隆抗体纯度的测定兔免疫血清经过辛酸-饱和硫酸铵方法纯化后，采用SDS-PAGE凝胶电泳对其进行纯度鉴定，以确定所得到的兔多抗具有较高的纯度。其结果如下图2-2所示，抗酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多抗轻链和重链清晰可见，重链蛋白分子量在50kD左右，说明了抗酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白兔多抗纯度较高。图2-2兔多抗SDS-PAGE电泳结果图（M：低分子量蛋白Marker；1：酪蛋白多抗；2：α-乳白蛋白多抗；3：β-乳球蛋白多抗）2.4.3兔多克隆抗体浓度的测定根据BCA法测蛋白法制作的标准曲线如图2-1所示，标准方程为：y=0.10803x+0.41048，R2=0.99646，通过计算可得酪蛋白、α-乳白蛋白和β-乳球蛋白多抗浓度如表2-3，可以看出所制备的三种多抗浓度均较高（＞6mg/mL）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]基于胶体金免疫层析技术对中药材中黄曲霉毒素B1的定量检测研究[J]. 李耀磊,刘丽娜,姚云,赵小旭,周霞,金红宇,马双成. 中国药学杂志. 2019(17)
[2]基于金纳米花标记的免疫层析法检测牛奶中黄曲霉毒素M1[J]. 金玉,刘仁荣,裘雪梅. 食品研究与开发. 2019(13)
[3]胶体金免疫层析法快速测定蜂胶及蜂胶乙醇提取物中氯霉素残留[J]. 周萍,李樱红,尹志红,吕泽田,尹君,王静,徐初. 中国蜂业. 2019(05)
[4]草鱼过敏原蛋白质的分离及其免疫学特性初步鉴定[J]. 陈献雄,邬玉兰,刘志刚. 南昌大学学报(医学版). 2018(01)
[5]动物过敏原牛血清白蛋白间接竞争ELISA检测方法的建立[J]. 朱业培,王玮,吕青骎,钱行,徐幸莲,周光宏. 南京农业大学学报. 2016(02)
[6]牛奶过敏原β-乳球蛋白的单克隆抗体制备及其双抗体夹心法的建立[J]. 陈献雄,邬玉兰,吉琼梅,杨平常,刘志刚. 食品安全质量检测学报. 2015(11)
[7]食品过敏原快速检测技术方法研究进展[J]. 曾颖,蔡玮红. 包装与食品机械. 2015(03)
[8]过敏性疾病患者过敏原检测结果分析[J]. 杨德平. 国际检验医学杂志. 2015(07)
[9]中国312岁儿童自报食物过敏与食物不耐受的相关因素分析[J]. 张雅蓉,陈云,赵艾,李宏亮,母智深,张玉梅,王培玉. 卫生研究. 2015(02)
[10]荧光微球免疫层析法定量检测牛乳中酪蛋白[J]. 杨亚杰,倪小琴,王茜,游琼,张富生,赖卫华. 食品安全质量检测学报. 2014(07)
博士论文
[1]四类重要抗生素残留的免疫快速检测方法的研究[D]. 陈燕妮.江南大学 2017
[2]水产品中三类重要化学残留物快速检测方法的研究[D]. 徐乃丰.江南大学 2015
[3]拟除虫菊酯类农药免疫快速检测方法及其定量构效模型的建立[D]. 陈秀金.江南大学 2013
硕士论文
[1]TGEV单克隆抗体及抗原检测胶体金试纸条的制备[D]. 王一鹏.河北农业大学 2019
[2]澳洲坚果过敏原免疫分析方法的建立与应用[D]. 周柔柔.天津科技大学 2018
[3]金磁酶联免疫法检测牛乳过敏原酪蛋白、α-乳白蛋白的研究[D]. 潘丽.上海师范大学 2016
[4]抗GNA兔单克隆抗体的制备及其夹心ELISA检测体系的建立[D]. 沈金儿.浙江大学 2013
[5]农药2，4-D与通用Ⅱ型拟除虫菊酯完全抗原和多克隆抗体制备[D]. 许啸晨.上海师范大学 2012
本文编号：3499782
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