基于碳点分子印迹识别材料的革兰氏阴性菌信号分子（AHLs）快速检测技术研究
发布时间：2021-11-27 18:16
细菌性食品污染不仅会导致食物资源浪费,而且会造成严重的公共卫生安全隐患,针对细菌性食品污染的防控问题亟待解决。群体感应（Quorum Sensing,QS）系统及其信号分子的揭示可为细菌性食品污染的防控提供新思路。N-酰基-高丝氨酸内脂（N-acyl-homoserine Lactones,AHLs）是调控革兰氏阴性菌QS系统最典型的信号分子,开发新型的AHLs快速检测技术,可有效简化检测程序、缩短分析时间,对阐明食品腐败过程中QS系统调控机制以及开发新型防控策略具有重要意义。基于此,本文将分子印迹技术与荧光纳米材料结合,开发了一种新型的荧光分子印迹识别材料,基于该材料构建了快速、高效检测AHLs的分析方法,主要内容概述如下:制备一种可作为荧光识别元件的碳点（Carbon Dots,CDs）,并对其光学性能及信号转导性能进行探究。以2,5-二氨基苯磺酸作为单一碳前体物,采用一步水热法合成了N,S共掺杂的CDs,470～520 nm的激发波长下,在593 nm处显示出激发不依赖特征的荧光峰。通过对CDs的形貌、光学性能以及结构的表征,发现CDs粒径均匀,光学性质优异,且由于N,S杂原子的...
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
V.fischeri菌的群体感应系统调控机制示意图[4]
第一章绪论5图1-2细菌生物传感器的原理示意图[40]Fig.1-2Schematicdiagramofbacterialbiosensor1.3.2薄层层析法薄层层析法，是早期一种可替代高效液相色谱法的廉价、快速的方法，用于初步鉴定信号分子AHLs。1997年，Shaw等人[47]证明了在60%甲醇水溶液中（v/v）中使用薄层层析法可有效地分离不同链长的AHLs。基于此，McClean等人[39]利用紫色杆菌突变体CV026生物测定菌株，在薄层色谱板上检出了液化链球菌和小肠结肠炎耶尔森菌培养基上清液中的AHLs，发现该菌株可被一系列的AHLs及其类似物诱导，且对不同侧链长度的化合物灵敏度不同，证明了紫色杆菌突变体CV026在对菌株上清液中经提娶薄层色谱分离得到的AHLs混合物的检测具有多功能性。Ravn等人[20]又结合多种AHLs的检测体系，对食品中分离得到的148株肠杆菌科细菌的AHL分布及其产生的动力学进行了研究。采用薄层层析法对筛选的20株菌的AHLs进行了分析，确定了产生的AHLs类型以及AHLs浓度随时间的延长不断增加，证明了从食物中分离的肠杆菌科中，多种AHLs产生的现象普遍存在，进而评估了AHLs的调控作用在食品腐败过程中的重要性。该方法与其他色谱类的方法一样，通过目标物对流动相和固定相的亲和力不同，一般使用C18反相层析板将AHLs混合物进行分离，随后，利用生物报告菌法、硫酸法、联合色谱法等进行检测结果分析。其中，与生物报告菌法结合应用最广泛，将接种了信号分子AHLs敏感菌株的琼脂培养基涂覆到层析板表面，培养后通过观察颜色等表型进行定性检测，通过色素产生量或者酶活性的分析进行定量检测。该法的优势在于可对AHLs信号分子混合物进行分离检测，但由于结果分析依赖于生物报告菌法，因而其相应的劣势也同时存在。对信号分子的检测大部分只能定性且重复性较差，检测过
ヌ逵肽０宸肿又?浞⑸?ゲ剐纬煽占渑挪迹?诮涣?恋淖饔孟?进一步聚合后，除去模板分子，形成能够特异地重新结合目标分子的聚合物材料[60]。MIPs的成功制备必须具备模板分子、功能单体、交联剂以及引发剂4种元素，合成路线通常包括三个步骤：1）在模板分子与单体之间预聚合形成络合物；2）在交联剂作用下，通过自由基引发进行聚合；3）成功脱除模板分子制得MIPs，其制备流程示意图如图1-3所示[61]。一旦模板分子被脱除，便可获得一个三维网络结构的材料，该材料呈现出与模板分子互补的空穴以及官能团结合位点[62]。图1-3MIPs非共价印迹法制备工艺原理图[61]Fig.1-3Schematicdiagramofthemolecularimprintingprocessbynon-covalentimprintingmethod分子印迹技术可划分为共价印迹法、非共价印迹法以及半共价印迹法三种类型，其划分依据是模板分子与功能单体之间的键合方式不同[63]。共价印迹法是功能单体和模板分子之间聚合形成可逆共价键，该法制备的印迹聚合物的特点在于功能单体与模板分子之间的相互作用强，结合位点分布均匀，印迹效率高，但功能单体选择有限，模板的洗脱过程困难。更重要的是，由于共价键相互作用强烈以及结合和解离的过程迟缓，该过程难以达到热力学平衡。非共价印迹法是三种方法中最常用的方法，由于非共价键（离子相互作用、氢键，范德华力和螯合作用）是功能单体与模板分子之间最主要的结合方式。该法的制备过程简单、条件温和、应用范围广。与共价印迹法相比，需要大量的功能单体来促进模板-单体络合物的形成，不可避免地产生了更高密度的非选择性结合位点。在共价键合模板被移除后，也可以实现非共价再结合，这种方法被称为半共价印迹法。半共价印迹法结合前两者的优点，制备过程中以共价键相互作用使得结合位点
【参考文献】：
期刊论文
[1]食源性致病菌群体感应信号分子的检测[J]. 何伟佳,岳思远,王翔,孙天妹,董庆利. 生物工程学报. 2019(09)
[2]Determination of quorum-sensing signal substances in water and solid phases of activated sludge systems using liquid chromatography–mass spectrometry[J]. Yuepeng Sun,Kai He,Qidong Yin,Shinya Echigo,Guangxue Wu,Yuntao Guan. Journal of Environmental Sciences. 2018(07)
[3]食品腐败中细菌群体感应现象的研究进展[J]. 李学鹏,陈桂芳,仪淑敏,朱军莉,李婷婷,李春,励建荣. 食品与发酵工业. 2015(08)
[4]LC-MS/MS检测水产品源致病菌和腐败菌群体感应AHLs信号分子[J]. 黄旭镇,朱军莉,赵二科,梁新乐. 水产学报. 2014(07)
[5]冰鲜鲈鱼腐败菌AHLs的检测与货架期预测研究[J]. 刘宁,梁君妮,郝志军,耿金培,刘鹏. 食品研究与开发. 2013(23)
[6]气相色谱-质谱法检测细菌中N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子[J]. 郭秀春,郑立,张魁英,徐鲁燕,王小如. 分析测试学报. 2012(03)
[7]群体感应信号分子及其抑制剂快速检测方法的建立[J]. 储卫华,刘永旺,朱卫. 生物技术通报. 2011(03)
[8]HPLC-MS法检测N-酰基-高丝氨酸内酯类信号分子[J]. 綦国红,董明盛,吴胜明,陈晓红,姜梅. 分析测试学报. 2007(03)
[9]AHL 感应菌株生物检测铜绿假单胞菌变异株[J]. 詹克航,岳克筱,孙明,陈守文,喻子牛. 中华医学杂志. 2006(37)
本文编号：3522805
【文章来源】：江南大学江苏省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
V.fischeri菌的群体感应系统调控机制示意图[4]
第一章绪论5图1-2细菌生物传感器的原理示意图[40]Fig.1-2Schematicdiagramofbacterialbiosensor1.3.2薄层层析法薄层层析法，是早期一种可替代高效液相色谱法的廉价、快速的方法，用于初步鉴定信号分子AHLs。1997年，Shaw等人[47]证明了在60%甲醇水溶液中（v/v）中使用薄层层析法可有效地分离不同链长的AHLs。基于此，McClean等人[39]利用紫色杆菌突变体CV026生物测定菌株，在薄层色谱板上检出了液化链球菌和小肠结肠炎耶尔森菌培养基上清液中的AHLs，发现该菌株可被一系列的AHLs及其类似物诱导，且对不同侧链长度的化合物灵敏度不同，证明了紫色杆菌突变体CV026在对菌株上清液中经提娶薄层色谱分离得到的AHLs混合物的检测具有多功能性。Ravn等人[20]又结合多种AHLs的检测体系，对食品中分离得到的148株肠杆菌科细菌的AHL分布及其产生的动力学进行了研究。采用薄层层析法对筛选的20株菌的AHLs进行了分析，确定了产生的AHLs类型以及AHLs浓度随时间的延长不断增加，证明了从食物中分离的肠杆菌科中，多种AHLs产生的现象普遍存在，进而评估了AHLs的调控作用在食品腐败过程中的重要性。该方法与其他色谱类的方法一样，通过目标物对流动相和固定相的亲和力不同，一般使用C18反相层析板将AHLs混合物进行分离，随后，利用生物报告菌法、硫酸法、联合色谱法等进行检测结果分析。其中，与生物报告菌法结合应用最广泛，将接种了信号分子AHLs敏感菌株的琼脂培养基涂覆到层析板表面，培养后通过观察颜色等表型进行定性检测，通过色素产生量或者酶活性的分析进行定量检测。该法的优势在于可对AHLs信号分子混合物进行分离检测，但由于结果分析依赖于生物报告菌法，因而其相应的劣势也同时存在。对信号分子的检测大部分只能定性且重复性较差，检测过
ヌ逵肽０宸肿又?浞⑸?ゲ剐纬煽占渑挪迹?诮涣?恋淖饔孟?进一步聚合后，除去模板分子，形成能够特异地重新结合目标分子的聚合物材料[60]。MIPs的成功制备必须具备模板分子、功能单体、交联剂以及引发剂4种元素，合成路线通常包括三个步骤：1）在模板分子与单体之间预聚合形成络合物；2）在交联剂作用下，通过自由基引发进行聚合；3）成功脱除模板分子制得MIPs，其制备流程示意图如图1-3所示[61]。一旦模板分子被脱除，便可获得一个三维网络结构的材料，该材料呈现出与模板分子互补的空穴以及官能团结合位点[62]。图1-3MIPs非共价印迹法制备工艺原理图[61]Fig.1-3Schematicdiagramofthemolecularimprintingprocessbynon-covalentimprintingmethod分子印迹技术可划分为共价印迹法、非共价印迹法以及半共价印迹法三种类型，其划分依据是模板分子与功能单体之间的键合方式不同[63]。共价印迹法是功能单体和模板分子之间聚合形成可逆共价键，该法制备的印迹聚合物的特点在于功能单体与模板分子之间的相互作用强，结合位点分布均匀，印迹效率高，但功能单体选择有限，模板的洗脱过程困难。更重要的是，由于共价键相互作用强烈以及结合和解离的过程迟缓，该过程难以达到热力学平衡。非共价印迹法是三种方法中最常用的方法，由于非共价键（离子相互作用、氢键，范德华力和螯合作用）是功能单体与模板分子之间最主要的结合方式。该法的制备过程简单、条件温和、应用范围广。与共价印迹法相比，需要大量的功能单体来促进模板-单体络合物的形成，不可避免地产生了更高密度的非选择性结合位点。在共价键合模板被移除后，也可以实现非共价再结合，这种方法被称为半共价印迹法。半共价印迹法结合前两者的优点，制备过程中以共价键相互作用使得结合位点
【参考文献】：
期刊论文
[1]食源性致病菌群体感应信号分子的检测[J]. 何伟佳,岳思远,王翔,孙天妹,董庆利. 生物工程学报. 2019(09)
[2]Determination of quorum-sensing signal substances in water and solid phases of activated sludge systems using liquid chromatography–mass spectrometry[J]. Yuepeng Sun,Kai He,Qidong Yin,Shinya Echigo,Guangxue Wu,Yuntao Guan. Journal of Environmental Sciences. 2018(07)
[3]食品腐败中细菌群体感应现象的研究进展[J]. 李学鹏,陈桂芳,仪淑敏,朱军莉,李婷婷,李春,励建荣. 食品与发酵工业. 2015(08)
[4]LC-MS/MS检测水产品源致病菌和腐败菌群体感应AHLs信号分子[J]. 黄旭镇,朱军莉,赵二科,梁新乐. 水产学报. 2014(07)
[5]冰鲜鲈鱼腐败菌AHLs的检测与货架期预测研究[J]. 刘宁,梁君妮,郝志军,耿金培,刘鹏. 食品研究与开发. 2013(23)
[6]气相色谱-质谱法检测细菌中N-酰基高丝氨酸内酯类信号分子[J]. 郭秀春,郑立,张魁英,徐鲁燕,王小如. 分析测试学报. 2012(03)
[7]群体感应信号分子及其抑制剂快速检测方法的建立[J]. 储卫华,刘永旺,朱卫. 生物技术通报. 2011(03)
[8]HPLC-MS法检测N-酰基-高丝氨酸内酯类信号分子[J]. 綦国红,董明盛,吴胜明,陈晓红,姜梅. 分析测试学报. 2007(03)
[9]AHL 感应菌株生物检测铜绿假单胞菌变异株[J]. 詹克航,岳克筱,孙明,陈守文,喻子牛. 中华医学杂志. 2006(37)
本文编号：3522805
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