黄曲霉毒素B 1 核酸适体筛选和检测方法的建立
发布时间：2022-02-21 20:46
黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1,AFB1）是以二呋喃环和氧杂萘邻酮为基本结构的一类化合物,是一种毒性极强的真菌毒素,被世界卫生组织癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物,可引起肝癌等多种疾病,极易污染花生、玉米、小麦等农产品及其食品,快速灵敏的AFB1检测方法的研发及应用是防止其食品安全事件发生的基础。核酸适配体是一段能与靶标分子高亲和力、特异性结合的单链寡核苷酸序列,具有稳定的二级结构和特殊的三维构象,被誉为“化学抗体”,可通过指数富集配体的系统进化技术从体外筛选获得。本试验利用非固定氧化石墨烯法筛选AFB1适配体,并以所获得的AFB1适配体为特异性识别探针,纳米金为指示剂,建立了一种AFB1的比色检测方法,为食品安全提供技术支持。AFB1特异性适配体的氧化石墨烯-SELEX筛选。基于氧化石墨烯可通过π-π共轭吸附单链寡核苷酸ssDNA,而对已结合靶标的ssDNA吸附能力较弱的特性,设计了针对AFB1...
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
1.1 黄曲霉毒素B_1的研究进展
1.1.1 真菌毒素的概述
1.1.2 黄曲霉毒素B
1.1.3 黄曲霉毒素B_1 的限量标准
1.1.4 黄曲霉毒素B_1 的检测方法
1.2 SELEX技术及核酸适配体
1.2.1 SELEX技术简介
1.2.2 SELEX技术筛选的方法
1.2.3 核酸适配体的概述
1.2.4 核酸适配体的优点
1.2.5 核酸适配体在检测中的应用
1.3 本试验的立题意义与内容
1.3.1 本试验的立题意义
1.3.2 本试验的研究内容
第二章 非固定GO-SELEX筛选黄曲霉毒素B_1 适配体方法的建立
2.1 前言
2.2 主要材料与设备
2.2.1 随机单链DNA文库和引物的构建
2.2.2 主要试剂
2.2.3 主要缓冲液的配置
2.2.4 主要仪器设备
2.3 试验方法
2.3.1 氧化石墨烯与随机文库吸附条件的优化
2.3.2 ssDNA与氧化石墨烯孵育比例和时间的优化
2.3.3 正向筛选
2.3.4 反向筛选
2.3.5 PCR扩增体系和反应条件
2.3.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳验证PCR扩增产物
2.3.7 PCR产物的纯化
2.3.8 磁珠分离法制备次级文库
2.3.9 回收率的计算
2.3.10 终轮筛选
2.4 结果与分析
2.4.1 随机文库与氧化石墨烯吸附条件的优化
2.4.2 ssDNA与 GO质量比例和时间的优化
2.4.3 各轮筛选产物的验证
2.4.4 PCR扩增体系退火温度的优化
2.4.5 PCR扩增体系循环次数的优化
2.4.6 筛选轮数的确定
2.5 讨论
2.6 小结
第三章 黄曲霉毒素B_1核酸适配体的克隆和测序
3.1 试验材料与仪器
3.1.1 试验试剂
3.1.2 缓冲液和培养基的配置
3.1.3 仪器设备
3.2 试验方法
3.2.1 ssDNA的克隆
3.2.2 ssDNA的转化
3.2.3 阳性克隆的菌液PCR鉴定和测序
3.2.4 核酸适配体序列分析及二级结构模拟
3.2.5 核酸适配体的亲和性试验
3.2.6 核酸适配体特异性分析试验
3.3 结果与分析
3.3.1 PCR纯化产物验证
3.3.2 克隆、测序及序列分析
3.3.3 候选核酸适配体的初级表征
3.3.4 解离常数与亲和力测定
3.3.5 候选适配体的特异性分析
3.4 讨论
3.5 小结
第四章基于适配体的纳米金粒子比色法检测黄曲霉毒素B_1
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 仪器
4.2.2 试剂
4.3 试验方法
4.3.1 纳米金的制备
4.3.2 纳米金浓度与适配体亲和性测定
4.3.3 氯化钠浓度
4.3.4 适配体的浓度
4.3.5 黄曲霉毒素B_1 的检测
4.3.6 特异性的检测
4.3.7 大米样品中黄曲霉毒素B_1 的加标回收测定
4.4 结果与分析
4.4.1 纳米金粒子比色法检测黄曲霉毒素B_1 实验原理的验证
4.4.2 氯化钠溶液浓度的优化
4.4.3 适配体吸附纳米金浓度的优化
4.4.4 甲醇含量的影响
4.4.5 线性范围和检出限
4.4.6 特异性分析
4.4.7 大米样品中黄曲霉毒素B_1 加标回收试验
4.5 讨论
4.6 小结
第五章 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
参考文献
作者简介
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究[J]. 杨歌,朱超,刘晓慧,王勇,屈锋. 分析化学. 2018(10)
[2]薄层色谱法检测玉米中黄曲霉毒素B1[J]. 冯莉. 现代畜牧科技. 2018(08)
[3]酶联免疫吸附法测定植物油中黄曲霉毒素B1[J]. 杨艳,吴鑫,朱应飞,翟平平,刘德,范宏伟. 食品安全质量检测学报. 2018(12)
[4]高效液相色谱-串联飞行时间质谱高通量筛查生鲜乳中兽药残留[J]. 田怀香,何玉洁,周兴鑫,郑小平,何亚斌,于海燕,陈臣. 食品科学. 2018(22)
[5]食品中黄曲霉毒素的危害及检测方法探讨[J]. 周浮萍,宋诗伟. 食品安全导刊. 2017(36)
[6]核酸适配体的体外筛选方法的最新研究进展[J]. 李亚楠,赵洁,张傲哲,谭琰,华茜,张子剑. 生物技术通报. 2017(04)
[7]食品中真菌毒素法规限量标准概述[J]. 刘青,邹志飞,余炀炀,黄宇婷,庞世琦. 中国酿造. 2017(01)
[8]核酸适配体在食品安全可视化检测中的应用研究进展[J]. 谭贵良,赵旭,刘妍,韦丽婷,李向丽. 基因组学与应用生物学. 2016(08)
[9]国内外真菌毒素检测方法研究现状及进展[J]. 张思思,陆继伟,王少敏,毛丹,苗水,季申. 食品安全质量检测学报. 2016(07)
[10]肽核酸探针在微生物快速检测中的应用[J]. 刘鹏,刘宁,王云霞,段效辉,尹伟力. 食品安全质量检测学报. 2016(04)
博士论文
[1]镰刀菌毒素核酸适配体的筛选及分析应用研究[D]. 陈秀娟.江南大学 2015
硕士论文
[1]核酸适配体文库的构建及ZEN适配体的初步筛选[D]. 侯思露.南昌大学 2018
[2]新城疫病毒核酸适配体的筛选研究[D]. 谭阳通.华南农业大学 2016
[3]氯霉素核酸适体的筛选及基于核酸适体生物传感器的建立[D]. 段烨.北京化工大学 2016
[4]基于适配体的食品中黄曲霉毒素B1和M1的生物传感器检测方法研究[D]. 陈璐.新疆农业大学 2015
[5]几种DNA生物传感器用于微小RNA和真菌毒素的检测[D]. 章溪.福建医科大学 2015
[6]单核细胞增生性李斯特菌适配子的筛选及其初步应用[D]. 徐宝霞.华中农业大学 2014
[7]阪崎肠杆菌适配体制备及其应用[D]. 韩晓晓.江南大学 2013
[8]氧化石墨烯对蛋白质和DNA的构象和功能的影响[D]. 魏晓磊.天津大学 2013
[9]真菌毒素寡核苷酸适配体的筛选与应用[D]. 王文凤.江南大学 2012
[10]四种真菌毒素检测方法的建立以及赭曲霉毒素A脱除方法的初步研究[D]. 杨超.中国海洋大学 2009
本文编号：3638013
【文章来源】：河北农业大学河北省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
1.1 黄曲霉毒素B_1的研究进展
1.1.1 真菌毒素的概述
1.1.2 黄曲霉毒素B
1.1.3 黄曲霉毒素B_1 的限量标准
1.1.4 黄曲霉毒素B_1 的检测方法
1.2 SELEX技术及核酸适配体
1.2.1 SELEX技术简介
1.2.2 SELEX技术筛选的方法
1.2.3 核酸适配体的概述
1.2.4 核酸适配体的优点
1.2.5 核酸适配体在检测中的应用
1.3 本试验的立题意义与内容
1.3.1 本试验的立题意义
1.3.2 本试验的研究内容
第二章 非固定GO-SELEX筛选黄曲霉毒素B_1 适配体方法的建立
2.1 前言
2.2 主要材料与设备
2.2.1 随机单链DNA文库和引物的构建
2.2.2 主要试剂
2.2.3 主要缓冲液的配置
2.2.4 主要仪器设备
2.3 试验方法
2.3.1 氧化石墨烯与随机文库吸附条件的优化
2.3.2 ssDNA与氧化石墨烯孵育比例和时间的优化
2.3.3 正向筛选
2.3.4 反向筛选
2.3.5 PCR扩增体系和反应条件
2.3.6 聚丙烯酰胺凝胶电泳验证PCR扩增产物
2.3.7 PCR产物的纯化
2.3.8 磁珠分离法制备次级文库
2.3.9 回收率的计算
2.3.10 终轮筛选
2.4 结果与分析
2.4.1 随机文库与氧化石墨烯吸附条件的优化
2.4.2 ssDNA与 GO质量比例和时间的优化
2.4.3 各轮筛选产物的验证
2.4.4 PCR扩增体系退火温度的优化
2.4.5 PCR扩增体系循环次数的优化
2.4.6 筛选轮数的确定
2.5 讨论
2.6 小结
第三章 黄曲霉毒素B_1核酸适配体的克隆和测序
3.1 试验材料与仪器
3.1.1 试验试剂
3.1.2 缓冲液和培养基的配置
3.1.3 仪器设备
3.2 试验方法
3.2.1 ssDNA的克隆
3.2.2 ssDNA的转化
3.2.3 阳性克隆的菌液PCR鉴定和测序
3.2.4 核酸适配体序列分析及二级结构模拟
3.2.5 核酸适配体的亲和性试验
3.2.6 核酸适配体特异性分析试验
3.3 结果与分析
3.3.1 PCR纯化产物验证
3.3.2 克隆、测序及序列分析
3.3.3 候选核酸适配体的初级表征
3.3.4 解离常数与亲和力测定
3.3.5 候选适配体的特异性分析
3.4 讨论
3.5 小结
第四章基于适配体的纳米金粒子比色法检测黄曲霉毒素B_1
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 仪器
4.2.2 试剂
4.3 试验方法
4.3.1 纳米金的制备
4.3.2 纳米金浓度与适配体亲和性测定
4.3.3 氯化钠浓度
4.3.4 适配体的浓度
4.3.5 黄曲霉毒素B_1 的检测
4.3.6 特异性的检测
4.3.7 大米样品中黄曲霉毒素B_1 的加标回收测定
4.4 结果与分析
4.4.1 纳米金粒子比色法检测黄曲霉毒素B_1 实验原理的验证
4.4.2 氯化钠溶液浓度的优化
4.4.3 适配体吸附纳米金浓度的优化
4.4.4 甲醇含量的影响
4.4.5 线性范围和检出限
4.4.6 特异性分析
4.4.7 大米样品中黄曲霉毒素B_1 加标回收试验
4.5 讨论
4.6 小结
第五章 结论与展望
5.1 结论
5.2 展望
参考文献
作者简介
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]毛细管电泳筛选盐酸克伦特罗核酸适配体的方法研究[J]. 杨歌,朱超,刘晓慧,王勇,屈锋. 分析化学. 2018(10)
[2]薄层色谱法检测玉米中黄曲霉毒素B1[J]. 冯莉. 现代畜牧科技. 2018(08)
[3]酶联免疫吸附法测定植物油中黄曲霉毒素B1[J]. 杨艳,吴鑫,朱应飞,翟平平,刘德,范宏伟. 食品安全质量检测学报. 2018(12)
[4]高效液相色谱-串联飞行时间质谱高通量筛查生鲜乳中兽药残留[J]. 田怀香,何玉洁,周兴鑫,郑小平,何亚斌,于海燕,陈臣. 食品科学. 2018(22)
[5]食品中黄曲霉毒素的危害及检测方法探讨[J]. 周浮萍,宋诗伟. 食品安全导刊. 2017(36)
[6]核酸适配体的体外筛选方法的最新研究进展[J]. 李亚楠,赵洁,张傲哲,谭琰,华茜,张子剑. 生物技术通报. 2017(04)
[7]食品中真菌毒素法规限量标准概述[J]. 刘青,邹志飞,余炀炀,黄宇婷,庞世琦. 中国酿造. 2017(01)
[8]核酸适配体在食品安全可视化检测中的应用研究进展[J]. 谭贵良,赵旭,刘妍,韦丽婷,李向丽. 基因组学与应用生物学. 2016(08)
[9]国内外真菌毒素检测方法研究现状及进展[J]. 张思思,陆继伟,王少敏,毛丹,苗水,季申. 食品安全质量检测学报. 2016(07)
[10]肽核酸探针在微生物快速检测中的应用[J]. 刘鹏,刘宁,王云霞,段效辉,尹伟力. 食品安全质量检测学报. 2016(04)
博士论文
[1]镰刀菌毒素核酸适配体的筛选及分析应用研究[D]. 陈秀娟.江南大学 2015
硕士论文
[1]核酸适配体文库的构建及ZEN适配体的初步筛选[D]. 侯思露.南昌大学 2018
[2]新城疫病毒核酸适配体的筛选研究[D]. 谭阳通.华南农业大学 2016
[3]氯霉素核酸适体的筛选及基于核酸适体生物传感器的建立[D]. 段烨.北京化工大学 2016
[4]基于适配体的食品中黄曲霉毒素B1和M1的生物传感器检测方法研究[D]. 陈璐.新疆农业大学 2015
[5]几种DNA生物传感器用于微小RNA和真菌毒素的检测[D]. 章溪.福建医科大学 2015
[6]单核细胞增生性李斯特菌适配子的筛选及其初步应用[D]. 徐宝霞.华中农业大学 2014
[7]阪崎肠杆菌适配体制备及其应用[D]. 韩晓晓.江南大学 2013
[8]氧化石墨烯对蛋白质和DNA的构象和功能的影响[D]. 魏晓磊.天津大学 2013
[9]真菌毒素寡核苷酸适配体的筛选与应用[D]. 王文凤.江南大学 2012
[10]四种真菌毒素检测方法的建立以及赭曲霉毒素A脱除方法的初步研究[D]. 杨超.中国海洋大学 2009
本文编号：3638013
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