小米醇溶蛋白肽的制备及其抗氧化与抗炎活性研究
发布时间：2023-05-18 23:21
小米蛋白具有低过敏性的优良特点,必需氨基酸含量高于小麦和大米,是一种良好的植物蛋白来源。小米蛋白的主要成分是醇溶蛋白,但由于醇溶蛋白含有大量疏水性氨基酸,难溶于水,存在酶水解度低、蛋白转化率不高等问题。此外,关于小米蛋白肽活性研究大多集中在抗氧化、免疫调节、降血压等方面,而对于其他生理活性的研究有限,且对于其在细胞水平以及动物机体内的活性评价较为欠缺。本文首先研究了小米醇溶蛋白(MP)的结构特征,并利用超声和加热预处理对其进行改性,然后通过酶法制备了具有抗氧化活性的小米醇溶蛋白肽(MPP)并考察了其活性稳定性;再次,应用细胞模型评价了MPP在细胞水平的抗氧化及抗炎活性,并探索了可能的作用机理;最后,研究了MPP在小鼠机体内的抗氧化及抗炎活性。主要研究结果如下:(1)利用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)、X射线衍射(XRD)、圆二色谱(CD)、原子力显微镜(AFM)、氨基酸组成测定等方法分析了小米醇溶蛋白的结构特征。结果表明,小米醇溶蛋白在11～25 kDa有3条谱带,17 kDa处谱带较明显。小米醇溶蛋白属于全α型结构,为非晶体无定形结构。小米醇溶蛋白呈圆棒状,外...
【文章页数】：94 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
中英文缩写对照表
第一章 绪论
1.1 小米蛋白简介
1.2 小米蛋白肽的制备研究现状
1.2.1 蛋白酶水解法
1.2.2 微生物发酵法
1.2.3 物理改性辅助酶解方法
1.3 小米蛋白肽的生物活性研究进展
1.3.1 抗氧化活性
1.3.2 免疫调节作用
1.3.3 抑菌活性
1.3.4 抑制ACE、α-淀粉酶和α-葡萄糖酶活性
1.3.5 肽的活性稳定性研究
1.4 肽的抗氧化及抗炎活性评价方法
1.4.1 体外化学法
1.4.2 细胞实验法
1.4.3 动物实验法
1.5 立题依据及研究意义
1.6 主要研究内容
第二章 小米醇溶蛋白的结构表征及其酶解工艺研究
2.1 前言
2.2 材料与设备
2.1.1 实验材料与试剂
2.1.2 仪器与设备
2.3 实验方法
2.3.1 小米脱脂方法
2.3.2 小米蛋白的提取
2.3.3 SDS-PAGE分析
2.3.4 圆二色光谱分析(CD)
2.3.5 X射线衍射分析(XRD)
2.3.6 原子力显微镜分析(AFM)
2.3.7 氨基酸组成分析
2.3.8 超声及热处理方法
2.3.9 酶解工艺方法
2.3.10 溶解度测定
2.3.11 水解度测定
2.3.12 数据统计与分析
2.4 结果与分析
2.4.1 小米蛋白的分子量分布
2.4.2 小米蛋白的二级结构
2.4.3 X射线衍射分析结果
2.4.4 小米蛋白的形态特征
2.4.5 小米醇溶蛋白的氨基酸组成
2.4.6 超声及热处理对小米醇溶蛋白结构的影响
2.4.7 超声及热处理对小米醇溶蛋白溶解度的影响
2.4.8 超声及热处理对小米醇溶蛋白水解度的影响
2.5 本章小结
第三章 小米醇溶蛋白抗氧化肽的分离纯化、鉴定及活性稳定性评价
3.1 前言
3.2 材料与设备
3.2.1 材料与试剂
3.2.2 仪器与设备
3.3 实验方法
3.3.1 活性肽的超滤分离
3.3.2 活性肽的分子量分布测定
3.3.3 活性肽的凝胶色谱分离及RP-HPLC分离纯化
3.3.4 活性肽的抗氧化能力测定
3.3.5 活性肽的氨基酸序列测定
3.3.6 活性肽的化学合成
3.3.7 肽的抗氧化活性稳定性评价
3.3.8 数据统计与分析
3.4 结果与分析
3.4.1 不同分子量小米醇溶蛋白酶解产物的抗氧化活性
3.4.2 活性肽的分离纯化及结构鉴定
3.4.3 合成肽的抗氧化活性验证
3.4.4 温度对小米醇溶蛋白肽抗氧化活性的影响
3.4.5 pH对小米醇溶蛋白肽抗氧化活性的影响
3.4.6 食品原辅料对小米醇溶蛋白肽抗氧化活性的影响
3.4.7 金属离子对小米醇溶蛋白肽抗氧化活性的影响
3.4.8 体外模拟胃肠道消化对小米醇溶蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响
3.5 本章小结
第四章 小米醇溶蛋白肽在细胞内的抗氧化及抗炎活性研究
4.1 前言
4.2 材料与设备
4.2.1 材料与试剂
4.2.2 仪器与设备
4.3 实验方法
4.3.1 细胞培养与分组
4.3.2 细胞毒性实验(CCK-8)
4.3.3 HaCaT细胞内ROS测定
4.3.4 HaCaT细胞内MDA、GSH含量和SOD、CAT活力的测定
4.3.5 RAW264.7细胞中NO含量检测
4.3.6 促炎因子浓度检测
4.3.7 Western blot检测
4.3.8 数据统计与分析
4.4 结果与分析
4.4.1 小米醇溶蛋白肽对HaCaT细胞毒性的影响
4.4.2 小米醇溶蛋白肽作用于HaCaT细胞后的ROS荧光染色结果
4.4.3 小米醇溶蛋白肽对HaCaT细胞内MDA、GSH含量的影响
4.4.4 小米醇溶蛋白肽对HaCaT细胞内SOD、CAT酶活的影响
4.4.5 小米醇溶蛋白肽对RAW264.7细胞毒性及形态的影响
4.4.6 小米醇溶蛋白肽对RAW264.7 细胞释放NO及合成TNF-α、IL-6和IL-1β的影响
4.4.7 小米醇溶蛋白肽对RAW264.7 细胞中p-IκBα和 NF-κB表达的影响
4.4.8 小米醇溶蛋白肽对MAPK信号通路中蛋白磷酸化的影响
4.5 本章小结
第五章 小米醇溶蛋白肽在动物机体内的抗氧化及抗炎活性研究
5.1 前言
5.2 材料与设备
5.2.1 材料与试剂
5.2.2 仪器与设备
5.3 实验方法
5.3.1 D-半乳糖氧化损伤小鼠模型分组与给药处理
5.3.2 血清和组织匀浆液制备
5.3.3 组织和血清中抗氧化能力相关指标的测定
5.3.4 DSS诱导小鼠模型分组与给药处理
5.3.5 结肠炎症症状评估方法
5.3.6 MPO、TNF-α以及IL-6浓度的检测
5.3.7 数据统计与分析
5.4 结果与分析
5.4.1 D-半乳糖氧化损伤小鼠的一般行为学观察
5.4.2 小米醇溶蛋白肽对D-半乳糖氧化损伤小鼠脏器指数的影响
5.4.3 小米醇溶蛋白肽对D-半乳糖氧化损伤小鼠血清中T-AOC、细胞保护酶活性及MDA水平的影响
5.4.4 小米醇溶蛋白肽对D-半乳糖氧化损伤小鼠脑组织中细胞保护酶活性及MDA水平的影响
5.4.5 小米醇溶蛋白肽对D-半乳糖氧化损伤小鼠心脏组织中细胞保护酶活性及MDA水平的影响
5.4.6 小米醇溶蛋白肽对D-半乳糖氧化损伤小鼠肝脏组织中细胞保护酶活性及MDA水平的影响
5.4.7 小米醇溶蛋白肽对DSS诱导结肠炎小鼠的临床症状的影响
5.4.8 小米醇溶蛋白肽对结肠炎小鼠结肠组织中MPO、TNF-α以及IL-6 含量的影响
5.5 本章小结
主要结论与展望
主要结论
展望
主要创新点
致谢
参考文献
附录 Ⅰ:附图
附录 Ⅱ:作者在攻读博士学位期间发表的论文
本文编号：3819199
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【学位级别】：博士
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摘要
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第一章 绪论
1.1 小米蛋白简介
1.2 小米蛋白肽的制备研究现状
1.2.1 蛋白酶水解法
1.2.2 微生物发酵法
1.2.3 物理改性辅助酶解方法
1.3 小米蛋白肽的生物活性研究进展
1.3.1 抗氧化活性
1.3.2 免疫调节作用
1.3.3 抑菌活性
1.3.4 抑制ACE、α-淀粉酶和α-葡萄糖酶活性
1.3.5 肽的活性稳定性研究
1.4 肽的抗氧化及抗炎活性评价方法
1.4.1 体外化学法
1.4.2 细胞实验法
1.4.3 动物实验法
1.5 立题依据及研究意义
1.6 主要研究内容
第二章 小米醇溶蛋白的结构表征及其酶解工艺研究
2.1 前言
2.2 材料与设备
2.1.1 实验材料与试剂
2.1.2 仪器与设备
2.3 实验方法
2.3.1 小米脱脂方法
2.3.2 小米蛋白的提取
2.3.3 SDS-PAGE分析
2.3.4 圆二色光谱分析(CD)
2.3.5 X射线衍射分析(XRD)
2.3.6 原子力显微镜分析(AFM)
2.3.7 氨基酸组成分析
2.3.8 超声及热处理方法
2.3.9 酶解工艺方法
2.3.10 溶解度测定
2.3.11 水解度测定
2.3.12 数据统计与分析
2.4 结果与分析
2.4.1 小米蛋白的分子量分布
2.4.2 小米蛋白的二级结构
2.4.3 X射线衍射分析结果
2.4.4 小米蛋白的形态特征
2.4.5 小米醇溶蛋白的氨基酸组成
2.4.6 超声及热处理对小米醇溶蛋白结构的影响
2.4.7 超声及热处理对小米醇溶蛋白溶解度的影响
2.4.8 超声及热处理对小米醇溶蛋白水解度的影响
2.5 本章小结
第三章 小米醇溶蛋白抗氧化肽的分离纯化、鉴定及活性稳定性评价
3.1 前言
3.2 材料与设备
3.2.1 材料与试剂
3.2.2 仪器与设备
3.3 实验方法
3.3.1 活性肽的超滤分离
3.3.2 活性肽的分子量分布测定
3.3.3 活性肽的凝胶色谱分离及RP-HPLC分离纯化
3.3.4 活性肽的抗氧化能力测定
3.3.5 活性肽的氨基酸序列测定
3.3.6 活性肽的化学合成
3.3.7 肽的抗氧化活性稳定性评价
3.3.8 数据统计与分析
3.4 结果与分析
3.4.1 不同分子量小米醇溶蛋白酶解产物的抗氧化活性
3.4.2 活性肽的分离纯化及结构鉴定
3.4.3 合成肽的抗氧化活性验证
3.4.4 温度对小米醇溶蛋白肽抗氧化活性的影响
3.4.5 pH对小米醇溶蛋白肽抗氧化活性的影响
3.4.6 食品原辅料对小米醇溶蛋白肽抗氧化活性的影响
3.4.7 金属离子对小米醇溶蛋白肽抗氧化活性的影响
3.4.8 体外模拟胃肠道消化对小米醇溶蛋白肽抗氧化活性稳定性的影响
3.5 本章小结
第四章 小米醇溶蛋白肽在细胞内的抗氧化及抗炎活性研究
4.1 前言
4.2 材料与设备
4.2.1 材料与试剂
4.2.2 仪器与设备
4.3 实验方法
4.3.1 细胞培养与分组
4.3.2 细胞毒性实验(CCK-8)
4.3.3 HaCaT细胞内ROS测定
4.3.4 HaCaT细胞内MDA、GSH含量和SOD、CAT活力的测定
4.3.5 RAW264.7细胞中NO含量检测
4.3.6 促炎因子浓度检测
4.3.7 Western blot检测
4.3.8 数据统计与分析
4.4 结果与分析
4.4.1 小米醇溶蛋白肽对HaCaT细胞毒性的影响
4.4.2 小米醇溶蛋白肽作用于HaCaT细胞后的ROS荧光染色结果
4.4.3 小米醇溶蛋白肽对HaCaT细胞内MDA、GSH含量的影响
4.4.4 小米醇溶蛋白肽对HaCaT细胞内SOD、CAT酶活的影响
4.4.5 小米醇溶蛋白肽对RAW264.7细胞毒性及形态的影响
4.4.6 小米醇溶蛋白肽对RAW264.7 细胞释放NO及合成TNF-α、IL-6和IL-1β的影响
4.4.7 小米醇溶蛋白肽对RAW264.7 细胞中p-IκBα和 NF-κB表达的影响
4.4.8 小米醇溶蛋白肽对MAPK信号通路中蛋白磷酸化的影响
4.5 本章小结
第五章 小米醇溶蛋白肽在动物机体内的抗氧化及抗炎活性研究
5.1 前言
5.2 材料与设备
5.2.1 材料与试剂
5.2.2 仪器与设备
5.3 实验方法
5.3.1 D-半乳糖氧化损伤小鼠模型分组与给药处理
5.3.2 血清和组织匀浆液制备
5.3.3 组织和血清中抗氧化能力相关指标的测定
5.3.4 DSS诱导小鼠模型分组与给药处理
5.3.5 结肠炎症症状评估方法
5.3.6 MPO、TNF-α以及IL-6浓度的检测
5.3.7 数据统计与分析
5.4 结果与分析
5.4.1 D-半乳糖氧化损伤小鼠的一般行为学观察
5.4.2 小米醇溶蛋白肽对D-半乳糖氧化损伤小鼠脏器指数的影响
5.4.3 小米醇溶蛋白肽对D-半乳糖氧化损伤小鼠血清中T-AOC、细胞保护酶活性及MDA水平的影响
5.4.4 小米醇溶蛋白肽对D-半乳糖氧化损伤小鼠脑组织中细胞保护酶活性及MDA水平的影响
5.4.5 小米醇溶蛋白肽对D-半乳糖氧化损伤小鼠心脏组织中细胞保护酶活性及MDA水平的影响
5.4.6 小米醇溶蛋白肽对D-半乳糖氧化损伤小鼠肝脏组织中细胞保护酶活性及MDA水平的影响
5.4.7 小米醇溶蛋白肽对DSS诱导结肠炎小鼠的临床症状的影响
5.4.8 小米醇溶蛋白肽对结肠炎小鼠结肠组织中MPO、TNF-α以及IL-6 含量的影响
5.5 本章小结
主要结论与展望
主要结论
展望
主要创新点
致谢
参考文献
附录 Ⅰ:附图
附录 Ⅱ:作者在攻读博士学位期间发表的论文
本文编号：3819199
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/qgylw/3819199.html
