亮氨酸氨肽酶的基因挖掘和在黑曲霉中的高效重组表达及其酶学性质研究
发布时间：2023-05-31 22:10
大豆分离蛋白在经过酶解处理后,肽链的大量断裂使肽链末端暴露出大量疏水性氨基酸残基,使得水解液中产生苦味,亮氨酸氨肽酶可水解多肽N端的疏水氨基酸,减少疏水性多肽的含量,降低水解液中的苦味,从而解决大豆蛋白在食品加工上的一大难题。本论文将来自曲霉和嗜热真菌的8个亮氨酸氨肽酶基因分别在宿主黑曲霉HL-1中进行重组表达,筛选得到高活性的亮氨酸氨肽酶基因lap A和The,并通过利用CRISPR/Cas9工具增加其基因拷贝数提高表达量,同时研究其纯化工艺和酶学性质,以及探究重组亮氨酸氨肽酶Thelap和碱性蛋白酶复配水解大豆分离蛋白在脱苦方面的应用,主要研究内容如下:(1)将杂合启动子Pna II分别与8个目的基因相连,构建8个不同目的基因的表达载体并转化宿主无孢黑曲霉HL-1,筛选得到高活性基因lap A和The,转化株Lap A-T和The-T亮氨酸氨肽酶活力分别可达到2212.3 U/m L和854.6 U/m L。为了进一步提高亮氨酸氨肽酶在黑曲霉中的表达水平,利用CRISPR/Cas9技术,增加亮氨酸氨肽酶基因在黑曲霉基因组中的拷贝数,多拷贝转化株Lap A-C和The-C亮氨酸氨肽酶...
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 氨肽酶概述
1.1.1 氨肽酶的来源和性质
1.1.2 氨肽酶的功能和用途
1.1.3 氨肽酶的分类
1.2 亮氨酸氨肽酶
1.2.1 亮氨酸氨肽酶的简介
1.2.2 亮氨酸氨肽酶的应用
1.3 氨肽酶研究现状
1.3.1 增强氨肽酶生产和性能改进的遗传方法
1.3.2 基因的过度表达和产量的提高
1.3.3 提高氨肽酶的酶学性质
1.4 黑曲霉表达系统和基因编辑技术
1.5 研究意义
1.6 本论文研究内容
第二章 亮氨酸氨肽酶的基因挖掘及其高效表达工程菌的筛选
2.1 引言
2.2 实验材料与设备
2.2.1 质粒与菌种
2.2.2 引物设计
2.2.3 实验材料
2.2.4 实验设备
2.3 实验方法
2.3.1 本章所选取的亮氨酸氨肽酶基因
2.3.2 氨肽酶表达载体的构建
2.3.3 无孢曲霉HL-1的转化
2.3.4 过量表达亮氨酸氨肽酶菌株的筛选
2.3.5 过量表达亮氨酸氨肽酶菌株的摇瓶发酵
2.3.6 亮氨酸氨肽酶活力的测定方法
2.3.7 蛋白含量的检测
2.4 实验结果与讨论
2.4.1 生物信息学分析
2.4.2 氨肽酶表达载体的构建
2.4.3 不同亮氨酸氨肽酶基因表达菌株的转化与鉴定
2.4.4 重组亮氨酸氨肽酶表达菌株的酶活测定
2.5 本章小结
第三章 利用CRISPR/Cas9 技术的表达策略提高氨肽酶基因lapA和 The的表达量
3.1 引言
3.2 实验材料与设备
3.2.1 质粒与菌种
3.2.2 引物设计
3.2.3 实验材料
3.2.4 实验设备
3.3 实验方法
3.3.1 利用CRISPR/Cas9 基因编辑工具进行无孢曲霉HL-1 的转化
3.3.2 过量表达亮氨酸氨肽酶基因转化子的筛选和分析
3.3.3 表达菌株目的基因拷贝数的测定
3.4 实验结果与讨论
3.4.1 lapA氨肽酶基因表达菌株的转化结果及对比
3.4.2 The氨肽酶基因表达菌株的转化结果及对比
3.5 本章小结
第四章 重组亮氨酸氨肽酶纯化和酶学性质研究及Thelap在大豆分离蛋白中的脱苦应用
4.1 引言
4.2 实验材料与设备
4.2.1 菌种
4.2.2 实验材料
4.2.3 实验设备
4.3 实验方法
4.3.1 重组亮氨酸氨肽酶的蛋白纯化研究
4.3.2 重组亮氨酸氨肽酶的Western blot分析
4.3.3 重组亮氨酸氨肽酶的酶学性质研究
4.3.4 重组亮氨酸氨肽酶Thelap在大豆分离蛋白中的脱苦应用
4.4 实验结果与讨论
4.4.1 重组亮氨酸氨肽酶的蛋白纯化结果
4.4.2 重组亮氨酸氨肽酶LapA的酶学性质研究
4.4.3 重组亮氨酸氨肽酶Thelap的酶学性质研究
4.4.4 重组亮氨酸氨肽酶Thelap在大豆分离蛋白中的脱苦应用
4.5 本章小结
结论与展望
本论文创新点
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
致谢
附件
本文编号：3826094
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
1.1 氨肽酶概述
1.1.1 氨肽酶的来源和性质
1.1.2 氨肽酶的功能和用途
1.1.3 氨肽酶的分类
1.2 亮氨酸氨肽酶
1.2.1 亮氨酸氨肽酶的简介
1.2.2 亮氨酸氨肽酶的应用
1.3 氨肽酶研究现状
1.3.1 增强氨肽酶生产和性能改进的遗传方法
1.3.2 基因的过度表达和产量的提高
1.3.3 提高氨肽酶的酶学性质
1.4 黑曲霉表达系统和基因编辑技术
1.5 研究意义
1.6 本论文研究内容
第二章 亮氨酸氨肽酶的基因挖掘及其高效表达工程菌的筛选
2.1 引言
2.2 实验材料与设备
2.2.1 质粒与菌种
2.2.2 引物设计
2.2.3 实验材料
2.2.4 实验设备
2.3 实验方法
2.3.1 本章所选取的亮氨酸氨肽酶基因
2.3.2 氨肽酶表达载体的构建
2.3.3 无孢曲霉HL-1的转化
2.3.4 过量表达亮氨酸氨肽酶菌株的筛选
2.3.5 过量表达亮氨酸氨肽酶菌株的摇瓶发酵
2.3.6 亮氨酸氨肽酶活力的测定方法
2.3.7 蛋白含量的检测
2.4 实验结果与讨论
2.4.1 生物信息学分析
2.4.2 氨肽酶表达载体的构建
2.4.3 不同亮氨酸氨肽酶基因表达菌株的转化与鉴定
2.4.4 重组亮氨酸氨肽酶表达菌株的酶活测定
2.5 本章小结
第三章 利用CRISPR/Cas9 技术的表达策略提高氨肽酶基因lapA和 The的表达量
3.1 引言
3.2 实验材料与设备
3.2.1 质粒与菌种
3.2.2 引物设计
3.2.3 实验材料
3.2.4 实验设备
3.3 实验方法
3.3.1 利用CRISPR/Cas9 基因编辑工具进行无孢曲霉HL-1 的转化
3.3.2 过量表达亮氨酸氨肽酶基因转化子的筛选和分析
3.3.3 表达菌株目的基因拷贝数的测定
3.4 实验结果与讨论
3.4.1 lapA氨肽酶基因表达菌株的转化结果及对比
3.4.2 The氨肽酶基因表达菌株的转化结果及对比
3.5 本章小结
第四章 重组亮氨酸氨肽酶纯化和酶学性质研究及Thelap在大豆分离蛋白中的脱苦应用
4.1 引言
4.2 实验材料与设备
4.2.1 菌种
4.2.2 实验材料
4.2.3 实验设备
4.3 实验方法
4.3.1 重组亮氨酸氨肽酶的蛋白纯化研究
4.3.2 重组亮氨酸氨肽酶的Western blot分析
4.3.3 重组亮氨酸氨肽酶的酶学性质研究
4.3.4 重组亮氨酸氨肽酶Thelap在大豆分离蛋白中的脱苦应用
4.4 实验结果与讨论
4.4.1 重组亮氨酸氨肽酶的蛋白纯化结果
4.4.2 重组亮氨酸氨肽酶LapA的酶学性质研究
4.4.3 重组亮氨酸氨肽酶Thelap的酶学性质研究
4.4.4 重组亮氨酸氨肽酶Thelap在大豆分离蛋白中的脱苦应用
4.5 本章小结
结论与展望
本论文创新点
参考文献
攻读硕士学位期间发表的学术论文
致谢
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