七-跨膜受体蛋白原位优化表达及功能研究

发布时间：2020-03-31 12:48

【摘要】：膜蛋白约占生物体内总蛋白数的20-30%,其中受体膜蛋白一直是生命科学和药物研发的热点。由于磷脂双分子层对膜蛋白的动态构象、信号转导,以及蛋白间的相互作用等具有重要的调制作用,尽可能地模拟膜蛋白所处的原生环境已成为对膜蛋白结构解析和功能研究的基本要求。然而,由于模拟膜的磷脂组成和不同重构方式终究无法重现原生膜环境,对膜蛋白结构和功能造成不同程度的影响,因此探索膜蛋白的优化表达和原位表征极为重要。七-跨膜受体蛋白是跨膜蛋白中最大的一个家族,根据其来源不同可以分为微生物类七-跨膜光受体蛋白和动物类七-跨膜受体蛋白。针对这两种不同类型的七-跨膜受体蛋白,本论文开展表达优化和原位表征研究。对于微生物类七-跨膜光受体蛋白,本论文选择古紫质-4(Archaerhodopsin-4,aR4)蛋白作为研究载体。aR4是在我国西藏扎北湖嗜盐菌H.sp.XZ515中发现的一种新型且未知结构的微生物类七-跨膜质子泵,因同时镶嵌有视黄醛及菌红素两个发色团而呈现紫红色,故称之为紫红膜。由于菌红素难以合成、且无法实现重构,因此无法采用模拟膜重构技术研究第二发色团菌红素在aR4蛋白中的作用。本工作首先利用嗜盐杆菌宿主细胞H.salinarum L33和H.salinarum MPK409分别实现aR4蛋白、内生磷脂与视黄醛第一发色团的同时表达,以及aR4蛋白、内生磷脂、视黄醛第一发色团与菌红素第二发色团的同时表达。进而采用二维固体核磁共振相关实验、光诱导瞬态吸收光谱实验、FTIR实验、稳定性测定、质子泵功能测定、pH滴定、动态光散射、以及ATP生成率测定等方法,深入研究了第二发色团菌红素对aR4键合区、质子泵功能和三聚结构的影响,并结合分子动力学模拟计算,在国际上首次报道了第二发色团菌红素对第一发色团视黄醛存在远程调控作用,建立了研究双发色团光受体蛋白的新方法。对于动物类七-跨膜受体蛋白,本论文以趋化因子受体CX3CR1在哺乳动物细胞HEK 293中的表达为例进行了两方面优化:1)将pcDNA4/TO四环素调控体系引入TRE-X 293细胞株;2)在CX3CR1的N末端引入Rho33序列,以期实现蛋白表达量的提高。在此基础上进一步探讨了将eGFP融合于CX3CR1的C末端的可行性,以期建立一种广泛适用于GPCRs的哺乳动物细胞调控表达及检测的平台。Western Blot检测和荧光结果显示融合蛋白Rho33-CX3CR1-eGFP的哺乳动物调控表达及检测平台构建成功,融合蛋白表达量得到了提升。这一体系的建立不仅有助于提高GPCRs在哺乳动物细胞中的表达,同时有利于细胞水平上GPCRs的动态观测以及GPCRs的原位功能研究。在此工作的基础上,本论文进一步构建了人源肾上腺素受体的两种融合蛋白WT-β3-AR-eGFP和W64R-β3-AR-eGFP,并利用激光共聚焦荧光显微镜初步探究了W64R突变亚型和野生型蛋白在胞内的定位,尝试解答W64R突变亚型致病的机理。尽管近年来膜蛋白结构的晶体解析取得了飞速发展,但由于生物膜自身组成的多样性、疏水性、流动性和不稳定性,原生膜环境下的蛋白结构解析和动态功能研究将是势在必行的发展趋势。本论文研究工作的开展,不仅对七-跨膜受体蛋白的优化表达和原位表征的重要性阐述具有重要的意义,同时对更深层次上认识七-跨膜受体蛋白功能与结构的关系也有一定的指导意义。此外,GPCRs与人类的多种疾病密切相关,本论文的工作为GPCRs结构的原位解析和以GPCRs为基础的药物设计提供了一定的实验基础。
【图文】：

模型图,生物细胞膜,蛋白结合,模型图

华东师范大学博士学位论文是承载生命的基本单元，且依赖于细胞膜所提供的闭合稳定双分子层形成主要架构，并在其上镶嵌许多蛋白，称之为膜因编码的蛋白中，膜蛋白约占蛋白总数的 20-30%[1]。根据膜蛋白分为：脂锚定蛋白（Lipid-anchored Protein）、外ral Membrane Protein）和整合膜蛋白（Integral Membrane Pr[2]。其中整合膜蛋白通过与磷脂的疏水相互作用部分插入分子层中，外周膜蛋白结合在细胞质膜或者整合膜蛋白表面定在磷脂双分子层胞外侧的蛋白。

侧区,模式图,跨膜蛋白,外部刺激

并产生相应的胞内生理学效应。七-跨膜受体蛋白的外部刺激多种多样，包括光子、离子、气味分子、脂质、激素、神经递质、代谢产物等[4, 5]。根据七-跨膜蛋白的来源差异，，可以将其分为两大类：1）微生物类七-跨膜光受体蛋白，主要存在于微生物细胞膜（古细菌、真细菌和低等真核生物）上；2）动物类七-跨膜受体蛋白，即 G-蛋白偶联受体（G-protein couple receptors，GPCRs），主要存在于动物的细胞膜上。这两类七-跨膜蛋白无论是从配体结合还是功能实现上都存在较大差异，但却都严格遵守七次跨膜的基本架构，能够更好的服务于信号的传递。首先，受体蛋白的主要作用是接受外部刺激，并引发胞内侧的反应，遵循这一原则，必然会形成 N 末端位于胞外，C 末端位于胞内或者 C 末端位于胞外而 N 末端位于胞内的这种奇数次跨膜结构；其次，受体蛋白需要结合相应的配体并产生构象变化，七个 -螺旋形成的空腔能够为配体结合提供相对良好的弹性空间。根据七-跨膜蛋白各部分相对于细胞膜的位置，可将其分为胞外侧区域，胞内侧区域和跨膜区域三个主要区域[6, 7]，如图 1.2 所示。
【学位授予单位】：华东师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q51

【参考文献】