Ⅴ型anti-CRISPR蛋白结构与功能机制研究

发布时间：2020-03-31 23:43

【摘要】：CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是细菌和古细菌在百万年的时间中在和噬菌体的对抗中获得的一种适应性免疫防御机制,该结构与一些功能相关的蛋白质(CRISPR-associated,Cas)合称CRISPR-Cas系统。由于其致突变效率高、操作简单及成本较低的特点,近年来对CRISPR/Cas系统的研究获得越来越广泛的关注。该系统迅速在各领域中得到广泛应用,被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。CRISPR蛋白是一类存在于细菌体内的免疫蛋白,在抵抗噬菌体侵染的过程中起到了至关重要的作用,在噬菌体侵染过后获得噬菌体的基因片段,进而编译到自身的DNA序列当中,在基因组上显示为一段重复序列即CRISPR,再利用其独有的通过RNA介导的特异性识别DNA序列能力,将再次侵染的噬菌体的DNA序列识别出来,利用CRISPR蛋白的结构域将噬菌体的DNA进行切割,达到免疫噬菌体的作用,而在亿万年的噬菌体和细菌的共进化过程中,噬菌体也进化出了可以抵抗CRISPR系统的机制,在这些机制中,作用最为明显的就是anti-CRISPR蛋白,anti-CRISPR蛋白普遍是编译在噬菌体的基因组中,在CRISPR蛋白起作用的各个关键节点中,其中anti蛋白与CRISPR的活性位点相结合阻碍CRISPR与底物结合这一个抑制机理是比较常见的机制。首先进行CRISPR及anti-CRISPR蛋白的纯化,然后进行复合物的组装,然后获得结构,获得结构主要有一下两种途径:1.复合物共结晶,得到晶体后在上海同步辐射光源进行数据收集后进行结构的解析,最终获得2.7A的蛋白质晶体结构;2.冷冻电镜,冷冻电镜收集数据后进行结构解析,最终获得蛋白质和anti蛋白的复合物结构。
【图文】：

大类,第一,复合物

的转录[33]。scade 相似，Csm 和 Cmr 复合物沿着成熟的 crRNA 组装，在5 (Csm4/Cmr3)结合。主干由 Cas7 家族蛋白 (type III-A/Cmr4 e III-B 为 Cmr6 和 Cmr1)组成，Cas11 (Csm2/Cmr5)和 Cas10 为通过 III 型效应复合物以 crRNA 依赖的方式与新生靶转录结合亚基(Csm3/Cmr4)每隔 6 个核苷酸裂解一次 ssRNA。DNA 的的手掌区域进行的，在这两种 III 型系统中都严格要求靶基因6 或相关 Csx1 家族的 RNases 常与 III 型 CRISPR-Cas 系统相关有研究表明，Csm 复合物的 Cas10 亚基不仅介导靶 DNA 的裂为环状腺苷酸，作为第二信使激活 Csm6 的 RNase 活性[38]。C赖于 Csm 复合物与靶 RNA 的结合，从而构成了一种调控机制触发强干扰。在大多数 III 型系统中，将 crRNA 的 5’端的重复以抑制 DNA 的分裂，并作为一种依赖 PAM 序列的自我识别和然而，，对于糠疹热球菌 III-B 型系统，揭示了 PAM 序列的必要谓的 RNA- pam (rPAM)位于靶 RNA 上 crRNA 互补序列的 3’端 Cmr 复合物的 DNA 裂解至关重要[40]。

并且至少靶 DNA 链被 RuvC 结构域切割[53]。催化反应的细 Cas12b 利用类似机制是合理的[54]。类 CRISPR-Cas 干扰系统 VI 型计算搜索导致 VI 型系统的鉴定，其由含有两个 RxxxxH 基义。这些图案是特色高等真核生物和原核生物核苷酸（HEases 中找到。VI 型系统编码含有 HEPN 的效应蛋白 Cas13，[55]，它可以切割 ssRNA[56]。Cas13 由与 crRNA 互补的''靶解靶 ssRNA，还降解侧枝 ssRNA，类似于 III 型系统中的 C然 Cas13 酶原则上可以通过在 NUC 叶的两个 HEPN 结构域组氨酸残基来切割任何 ssRNA，但 Cas13a 亚家族对于易断’表现出不同的偏好[58]。Cas13 酶由 crRNA 编程并由靶 ssRrRNA。 Cas13a 耐受 crRNA 中的外周错配：靶 ssRNA 双链用于 RNase 活性[59]。此外,靶标 ssRNA 的不含有鸟嘌呤原型3’对于 Cas13a 的激活是重要的，但在其他物种中可能不同需要在原型间隔区的每一侧都有一个PFS; 5’PFS是不含有N 或 NNA 在 3’ PFS 时是最常见的[61]。
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

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