延展显微镜在细胞膜蛋白分布研究中的应用

发布时间：2020-04-07 11:33

【摘要】：近年来,超分辨荧光显微镜不仅可以对原位细胞膜上的蛋白进行特异性标记,而且还可以达到单分子精度,实现纳米级的成像,这对于研究细胞膜上的蛋白分布特点具有重要作用。然而,细胞膜上的蛋白分布紧密,这对蛋白标记又提出了新的挑战,最近提出的延展显微镜将生物样品机械性放大进而突破了光学衍射,这就使得原本排列紧密的生物分子距离增加。本论文将延展显微镜(Expansion microscopy,ExM)与随机光学重构显微镜(Stochastic optical reconstruction microscopy,STORM)两种技术相结合,通过对扩展后的细胞膜上蛋白进行STORM成像,研究细胞膜上蛋白质的分布特点。采用延展显微镜操作方法将A549-GFP细胞黏附于凝胶上,利用转盘激光扫描共聚焦显微镜对凝胶扩展前后的细胞进行成像对比。结果显示,A549-GFP细胞随着凝胶的扩展,细胞也随之增大。细胞的增大倍数与扩展溶液中离子含量以及扩展时间都有关系,在去离子水中,细胞可获得最大倍数的扩展,各方向可达2.51±0.47倍。为了对细胞膜上蛋白质进行观察分析其分布特点,本论文分析对比了多种不同思路来制备扩展后的细胞膜,最终发现将细胞膜与凝胶共价靶向相连后,可以在扩展后的凝胶上撕取扩展后的细胞膜。利用上述制备的扩展后细胞膜经抗体特异性标记后,使用dSTORM进行成像发现,扩展后的细胞膜上Band III蛋白定位点密度从475.4±27.73μm~(-2)减小到386.9±40.86μm~(-2),簇密度从1.373±0.0898μm~(-2)减少到1.126±0.1066μm~(-2),扩展前较大的蛋白簇变小,细胞上蛋白簇的平均面积从11866±649.8 nm~2减少到5749±546.4 nm~2,簇内定位点数也减少,簇内平均点数140.1±9.927变为116.1±6.737。单个蛋白间距离也增加从47.61±2.62 nm变为77.81±5.21 nm。利用dSTORM对RNA aptamer标记的细胞膜外侧EpCAM蛋白进行成像也发现相同的结果,随着凝胶的扩展,细胞膜上蛋白簇的直径变小,簇内点数变少。而单个蛋白间距离增加,扩展前39.53±3.53 nm增加到扩展后92.11±6.75 nm,扩大了2.3倍。比抗体而言,RNA aptamer体积小,标记效率更高,荧光探针扩展后距离也增加更大,更有利于成像。这一研究成果证实延展显微镜和单分子定位显微镜两种超分辨显微镜的联合使用,对于研究细胞膜上蛋白的分布特点,阐明蛋白簇的形态结构具有重要意义。
【图文】：

原理图,原理,标记物,凝胶网络

图 1-1 延展显微镜的原理[13]Fig.1-1 Concept of expansion microscopy (ExM)[13]记的三功能团标记物结构示意图；b）ExM 标记图解，其中绿色代表细胞微凝胶网络结构；c) 三功能团标记物连接凝胶和生物样品的分子图解，紫色，灰色代表抗体，蓝色代表寡核苷酸片段，橙色圆点代表三功能团标记物烯酰基，绿色圆圈代表荧光分子；d) ExM 凝胶网络结构图，黑色圆点表示子水扩展后的凝胶网络结构图。atic of label that can be anchored to the gel at site of a biomolecule; b) Schematicules (green) and polymer network (orange); c) The label of b), hybridized to thearing secondary antibody top (top gray shape) bound via the primary (bottom grayules (purple), is incorporated into the gel (orange lines) via the methacryloyl grouchematic of collapsed polyelectrolyte network, showing cross linker (dot) and poe); e) Expanded network after H2O dialysis.展后的生物样品通过荧光显微镜进行成像，目前使用较多的是宽扫描转盘激光扫描共聚焦显微镜，凝胶经过 4.5 倍的线性扩展，E到 60~70 nm[25]。

原理图,原理图,凝胶,寡核苷酸链

图 1-2 iExM 原理图解[28]Fig.1-2 iterative ExM (iExM) concept[28]M 原理图解，a）生物样品；b）第一次凝胶；c）扩展；d）第二次凝胶再次扩展；f) - j）iExM 原理分子图解，，f）一抗（灰色）、偶联寡核苷（灰色）以及含有寡核苷酸链 A（绿色，与 A'互补）和甲基丙烯酰基（ I 标记生物分子（灰色圆圈）；g）第一次凝胶示意图（1 和 2 代表两个在双重去离子水中扩展后，带有荧光团（黄色）、寡核苷酸链 A'（紫色黑色圆点）的三功能团标签 II 与功能团标签 I 杂交示意图；i）第二次凝次合成的凝胶，再次进行扩展后生物分子（1 和 2）远离的示意图。ematic of iterative expansion.a) specimen; b) the first polyelectrolyte ged expansion.d) a second polyelectrolyte gel network, e) it is expanded after j) Molecular view of the iExM process. f)Biomolecules of interest (gra with a primary antibody followed by a secondary antibody conjugated to a') molecule, then a complementary DNA (green,sequence A) bearing a ydite, black dot). g) The sample (two example biomolecules are labeled "n a cleavable swellable polyelectrolyte gel (blue mesh). This gel incorporate at the gel-anchoring site, and it is expanded. h) A DNA oligo with thpurple strand) bearing a fluorophore (yellow star) and a new gelanchlack dot) is hybridized to the anchored A sequence DNA (green). i) A sec
【学位授予单位】：哈尔滨工业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q241

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