固氮酶基因在Synechocystis sp.PCC6803中的表达以及固氮菌的分离和鉴定

发布时间：2020-04-09 07:13

【摘要】：本研究通过高效表达载体pfq20将单细胞固氮蓝藻Cyanothecesp.PCC 8801的nifHDK基因和绿螺旋杆菌(Heliobacterium chlorum)nifH)基因分别整合至单细胞非固氮蓝藻Synechocystis sp.PCC 6803中,并进行转录和表达水平的检测,结果显示两种固氮微生物的nifHDK基因在Synechocystis sp.PCC 6803中均有转录,并且通过western blot检测到绿螺旋杆菌的NifH蛋白表达;同时,本研究将Synechocystis sp.PCC 6803中PmgR1基因的启动子以及Cyoanothece sp.PCC 8801nifB和nifH前的启动子序列与Cyanothece sp.PCC 8801nifH基因连接并整合至Synechocystis sp.PCC 6803基因组中,对转录和表达水平进行检测发现三种启动子作用下的nifH在Synechocystis sp.PCC 6803中均有表达,且表达量具有一定差异,在转录水平上,PmgR1基因启动子作用下的nifH转录水平明显受到光照条件的影响,在黑暗条件下转录水平持续增强,这些结果对在Synechocystis sp.PCC 6803中表达活性固氮酶蛋白具有一定参考意义。另一方面,本研究采用Doberener固体无氮培养基从具有发达根系的骆驼刺根际分离得到两株具有固氮潜力的新菌T3和T22,并分别从生理生化、化学成分以及遗传和进化分析方面进行鉴定,其中,T3属于假单胞菌属,将其命名为Pseudomonas urumqiensis sp.nov.,模式种为T3T(=ACCC 60124T=JCM 32830T),T22属于Chitinophaga属,将其命名为Chitinophaga alhagiae sp.nov.,模式种为T22T(=ACCC 60125T=KCTC 62518T)。
【图文】：

生物能源,藻株,质粒载体,青岛

８８０１？ｚ：／ＨＤｒ基因同源重组至载体Ｐｆｑ２０邋（中国科学院青岛生物能源与过程研究所吕雪逡逑峰课题组惠赠），得到质粒载体ｐｆｑ２０－ＨＣ？ｉ／？ＴＯ尺，ｐｆｑ２０－８８０１ｗ：／ＨＤ尺，具体载体构建逡逑图见图２－Ｕ逡逑ｆ邋＼逡逑＾邋§逦Ｕ逡逑ｓｉｒ０１￥Ｓ邋■：邋｜逦ｒ＾ｃ邋－ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ逦ｎｉｆＨＤＫ逡逑：逡逑ｉ邋＼＼＼＼＼＼＼＼＼ｎ逡逑Ｖ＼逦／邋／邋ｓｆｒｏｍ逡逑？邋ｒ邋户物逡逑Ｉ邋飞逡逑Ｈ逦／；ｙ邋ｓｌｒ０１６８逡逑＾邋Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ逡逑Ａｐ＇逦逦逦逡逑图２－１载体构建图逡逑２．２．３．表达检测逡逑将邋ｐｆｑ２０－８８０ｌ”丨／７／￡）尺，ｐｆｑ２０－ＨＣｗ：／？／Ｚ）Ａ：转化至办”ｅｃ／ｚｏｃ＾ｓｔａ邋ｓｐ．邋ＰＣＣ邋６８０３邋中，得逡逑到转化藻株邋Ｓｙｎ－１２２６－１２邋和邋Ｓｙｎ－１２２６－６。逡逑１７逡逑

藻株,引物组合,基因组

将转化藻株在连续光照的条件下进行培养，分别从ＤＮＡ整合水平上进行检测。采逡逑用不同的引物组合对转化藻株Ｓｙｎ－１２２６－１２和Ｓｙｎ－１２２６－６中外源的整合情况逡逑进行检测，得到符合目的条带大小的条带（图２－２），说明目的基因整合至办逡逑ｓｐ．邋ＰＣＣ邋６８０３基因组中，０１６８－Ｆ／Ｒ扩增没有５００ｂｐ条带，说明外源基因整合完全。逡逑图２－２分别用不同引物组合对转化藻株Ｓｙｎ－１２２６－１２和Ｓｙｎ－１２２６－６的基因组逡逑ＤＮＡ邋进行邋ＰＣＲ邋得到的产物：１，Ｐｒｂｃ－Ｆ／８８０１－Ｋ２－０９２６，邋２，邋８８０１－Ｈ１－０９２６／０１６８－Ｒ，３，逡逑０１６８－Ｆ／０１６８－Ｒ，邋４，邋Ｐｒｂｃ－Ｆ／ＨＣ－Ｋ２－０９２６，邋５，邋ＨＣ－Ｈ１－０９２６／０１６８－Ｒ，邋６，，邋０１６８－Ｆ／０１６８－Ｒ，逡逑Ｍ，从上至下依次为邋８０００ｂｐ、５０００邋ｂｐ、３０００邋ｂｐ、２０００邋ｂｐ、１０００邋ｂｐ、７５０邋ｂｐ、５００邋ｂｐ、逡逑２５０邋ｂｐ、１００邋（下文图中所用Ｍ相同）逡逑２．２．３．２蛋白水平Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ检测逡逑分别收集转化藻株Ｓｙｎ－１２２６－１２和Ｓｙｎ－１２２６－６的上清和沉淀蛋白，处理后进行逡逑ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ检测，一抗为本研究制备的ＮｉｆＨ多克隆抗体，二抗兔抗鼠抗体（康为世逡逑纪）
【学位授予单位】：中国农业科学院
【学位级别】：博士后
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q936;Q78

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