苯丙氨酸氨基变位酶制备、表征及催化机制解析

发布时间：2020-04-16 08:49

【摘要】：苯丙氨酸氨基变位酶(Phenylalanine aminomutase,PAM)是MIO(4-亚甲基-咪哇-5-酮)家族酶中的一种。MIO是由高度保守的三联体氨基酸(Ala-Gly-Ser)在蛋白质折叠过程中经过两次脱水形成的具有较强亲电性的基团,是一种不同于PLA、NADH等外源性辅因子的新型酶辅因子。MIO能够亲电进攻底物α-苯丙氨酸的氨基,导致底物的氨基从α-位变位至β-位,形成产物β-苯丙氨酸。因而PAM可以用来合成高附加价值的β-苯丙氨酸。为建立酶法生产β-苯丙氨酸的工艺,首先克隆来源于成团泛菌(Pantoea agglomerans)的苯丙氨酸氨基变位酶基因,构建PaPAM重组菌实现其在大肠杆菌中的高效表达并纯化制备高纯度的重组酶,对其发酵、诱导表达条件及酶学性质进行初步研究;在此基础上,利用同位素标记的方法采用核磁(NMR)、质谱(MS)解析PaPAM催化反应分子机制。本文优化了酶诱导表达以及催化反应的最佳条件并对其催化反应机制进行了初步解析为进一步设计合成β-苯丙氨酸奠定基础。主要研究内容如下:(1)克隆来源于Pantoea agglomerans的苯丙氨酸氨基变位酶基因(pam),构建重组苯丙氨酸氨基变位酶的大肠杆菌表达载体pET28a-pam转入大肠杆菌BL21中表达,采用亲和层析制备电泳纯的重组酶(PaPAM)并对其酶学性质进行表征。结果表明,成功克隆得到基因pam,长度为1626 bp,编码541个氨基酸长度的PaPAM,构建了大肠杆菌表达载体pET28a-pam,转入E.coli BL21中经IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达,镍柱亲和层析纯化获得电泳纯的重组PaPAM。该酶在最适反应条件下(30℃、pH9、1.5 mol/L NH4+),活力达到2.5 U/mg,在30～50℃、pH 8～10下PaPAM具有较高的稳定性,金属离子Na+、Mg2+、Ca2+、Fe3+对PaPAM活性影响较小;Mn2+、Zn2+、Cu2+抑制PaPAM的活性,表面活性剂SDS和Triton 100对PaPAM活性较强抑制作用。MS和NMR结果表明,重组PaPAM能异构化α-苯丙氨酸生成β-苯丙氨酸。(2)利用同位素标记的方法采用MS和NMR解析PaPAM催化反应分子机制。结果表明:将未带标记的底物α-苯丙氨酸于重水溶液中反应所生成产物分子量无变化证明该酶催化反应未从外界溶液中吸收氢质子;将15N标记以及3,3-D标记α-苯丙氨酸于水溶液中反应,依据反应过程中氢质子位置的变化,证明酶催化反应过程中α位氨基与pro-3R位氢质子发生分子内交换。PaPAM将底物的α-NH2传递至β位取代pro-3R氢质子的同时pro-3R氢转移到a位生成产物β-苯丙氨酸。(3)对该重组菌发酵过程中培养基成分及诱导表达条件优化。结果表明,该酶发酵过程中最佳碳源、氮源分别为甘油和胰蛋白胨且最适添加浓度均为1.5%;培养基中添加Mg2+、Ca2+、+对该重组菌生长及产酶影响较小,添加Zn2+则有抑制作用;诱导剂IPTG最佳加入时间为当菌体浓度OD668=0.6,添加终浓度为0.4 mmol/L,诱导表达最适温度为26℃,最佳诱导表达诱导时间为14h。
【图文】：

它们的衍生物立体选择性合成Ｐ－苯丙氨酸［１３］；邋Ｃｕｒｔｉｕｓ重排［１４］，例如通过中间体逡逑共轭加成ａ，Ｐ－不饱和酯和酰亚胺［１５］合成；以及通过不对称内酰胺合成或逡逑利用外消旋混合物中拆分对映体来进行合成ｔ１７Ｕ具体合成路线如下图１－１所示）。逡逑但由于对映体拆分合成Ｐ－氨基酸条件苛刻存在困难且化学合成方法存在生产工逡逑艺复杂、环境污染严重、生成多种副产物等缺陷，因此需要发展绿色、新颖、生逡逑产工艺简单的生物方法合成Ｐ？氨基酸。逡逑１逡逑

图１－２邋ＳＡＭ依赖型氨基变位酶催化反应机制逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ＳＡＭ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ邋ａｍｉｎｏｍｕｔａｓｅ逡逑ＳＡＭ依赖型氨基变位酶的作用机制［３Ｓ］（图１－２）与腺苷钴胺素依赖型氨基变逡逑位酶的作用机制类似，在催化过程中都需先形成５＇－脱氧腺苷自由基（Ａｄｏ）邋［３９，４°］。逡逑早在１９８７年Ｍｏｓｓ，Ｍ．等人就已通过同位素标记实验证明了邋Ａｄｏ在赖氨酸２，３－氨逡逑基变位酶中的作用［３８１然而Ａｄｏ的准确来源仍然不清楚，因为Ｓ－腺苷甲硫氨酸逡逑（ＳＡＭ）中的Ｃ－Ｓ键键能很高并不太可能发生均裂［４１］。最终认为［４Ｆｅ－４Ｓ］簇是将逡逑ＳＡＭ转化成甲硫氨酸和Ａｄｏ自由基的电子供体。越来越多的证据表明，，生物学逡逑中铁硫簇的协调性很强。在好几个有可能的电子转移机制中［４２］，都因为硫离子和逡逑４逡逑
【学位授予单位】：安徽工程大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;Q55

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本文编号：2629600