白沙蒿病毒诱导基因沉默体系的探索与建立

发布时间：2020-04-18 20:13

【摘要】：白沙蒿(Artemisia sphaerocephala)为菊科蒿属沙生灌木,对荒漠生态系统的维持和恢复具有重要意义,同时其富含亚油酸、维生素E等,具有一定保健功效。随白沙蒿转录组测序的完成,对该物种基因功能的认知迫切。病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术不需建立遗传转化体系,可快速验证植物基因功能,在非模式植物中被广泛应用。PDS(Phytoene desaturase,PDS)基因是合成类胡萝卜素的关键基因,该基因被沉默导致叶绿素合成途径被阻断,植物呈易分辨的“光漂白”表型,是探索VIGS体系的首选基因。本研究以白沙蒿为材料,选用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)为载体,PDS为目标基因,构建正反向重组载体。以注射法(Injection method,I)、真空渗透(Vacuum infiltration,V)、真空渗透+超声波(Vacuum infiltration+ultrasonic,V+U)三种接种方法,OD_(600)=0.5、0.8、1.0、1.5四种菌液浓度,将含有重组载体的农杆菌菌液对子叶期和真叶期幼苗分别各处理24组,探索VIGS体系在白沙蒿中的可行性。主要结果如下:(1)克隆得到441 bp白沙蒿PDS基因片段AsPDS-F和AsPDS-R,构建出TRV病毒的正反向重组载体pTRV_2-AsPDS-F、pTRV_2-AsPDS-R。(2)子叶期VIGS体系建立受接种方法、菌液浓度和靶基因插入方向的极显著影响。子叶期VIGS体系最佳处理组为V+U-1.5-R,白化程度达0.72,白化部位在第一、二对真叶处。(3)真叶期白沙蒿VIGS体系的建立,分别受接种方法和菌液浓度极显著和显著影响,靶基因插入方向对体系的建立无影响。真叶期白沙蒿VIGS最佳处理组为I-1.5-R,其白化程度为0.34,白化部位在第三、四对真叶处。(4)子叶期白沙蒿VIGS体系中14组处理产生阳性植株,白化程度总均值为0.15;真叶期5组处理产生阳性植株,白化程度总均值为0.05。子叶期产生的阳性植株和白化程度均优于真叶期。本研究在白沙蒿中建立了快速、高效的功能基因沉默体系,为后续该物种的基因功能研究提供了技术支撑。
【图文】：

丹青,原理,示意图,基因沉默

2008; Voinnet, 2001)。其中，已在高等植物中广因沉默（Post-transcription gene silencing，PTGS），而录后的基因沉默(Holzberget al., 2010; Ruiz and Baulc入，病毒诱导的基因沉默用于表征基因功能的一种基导基因沉默体系的作用机制一种 RNAi（RNA interference，RNA 干扰）下调基因的病毒侵染宿主，，向下调控内源基因的表达水平并引究靶基因功能(Fuet al., 2002; Kammen, 1997)。最早，式植物本氏烟草的研究(Burch-Smith et al., 2006)，这理论基础。病毒诱导的基因沉默包含 3 个关键步骤：段与合适的病毒载体进行重组；第二，将含有病毒载主植物；第三，利用植物抵抗病毒感染的防卫机制沉VIGS 机理属于 RNA 沉默范畴，包含两条途径。

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图 3-1 AsPDS-F、AsPDS-R 基因片段的获得在大肠杆菌中的检测化的 AsPDS-F、AsPDS-R 基因与线性载体连接后，转阳性单克隆。体 pTRV2-AsPDS-F 在大肠杆菌中的检测的 7 个阳性单克隆，进行菌液检测。均获得单一清晰条带（图 3-2），分别将其回收测序，得到序列信息结果，发现第 6 泳道目的片段与白沙蒿 PDS 序列一，无碱基突变（图 3-3），重组载体 pTRV2-AsPDS-F
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q943.2

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