不同来源裂解性多糖单加氧酶的酶学性质及功能研究

发布时间：2020-05-08 01:55

【摘要】：裂解性多糖单加氧酶(Lytic polysaccharide monooxygenase,LPMO)是最近发现的一类新型单铜氧化酶,通过氧化裂解多糖底物,增强糖苷水解酶(Glycoside Hydrolases,GH)对多糖的水解效率。LPMO分布广泛,在细菌、古菌、真菌和昆虫中均有报道,但不同生境微生物LPMO的性质比较和功能研究少见报道。本论文以放线菌、肠道细菌和古菌的AA10家族LPMO为研究对象,通过异源表达获得三种不同来源的LPMO,比较其酶学性质差异并鉴定其对几丁质的氧化活性,在此基础上,对LPMO在天蓝色链霉菌几丁质降解过程中的功能进行同源验证。首先,从Streptomyces coelicolor(天蓝色链霉菌,放线菌)、Enterococcus faecalis(粪肠球菌,肠道细菌)和Natrialbaceae archaeon(古菌)中获得三个AA10家族LPMO基因,构建大肠杆菌表达系统,获得三个LPMO重组蛋白:ScLPMO10G、Ef LPMO10B、NaLPMO10A,其氨基酸序列和蛋白结构与典型的AA10家族LPMO的同源性较高。其次,比较了三种LPMO的酶学特性,发现其均具有几丁质氧化活性,ScLPMO10G、Ef LPMO10B、Na LPMO10A对几丁质酶的水解效率分别提高50.93%、48.74%、50.11%。三种LPMO的最适反应温度、pH和稳定性不同,其中,古菌N.archaeon来源的Na LPMO10A在较高温度(60℃)、高pH(pH 10.0)及高浓度Na~+(1 mol/L)条件下的稳定性较好,在1 mol/L Na~+溶液中保温8 h仍有70%以上的相对酶活。最后,成功构建了过表达ScLPMO10E和ScLPMO10G的天蓝色链霉菌菌株ScΔ10E(+)和ScΔ10G(+),并实现了LPMO的过表达;以几丁质为唯一碳源生长时,ScΔ10E(+)和ScΔ10G(+)的胞外还原糖含量、胞外总几丁质酶活以及胞外酶系对几丁质的酶解效率均显著高于野生型菌株,几丁质酶解效率分别提高81.79%和224.74%,表明LPMO在链霉菌的几丁质降解中发挥重要作用。本文首次对不同生境微生物的LPMO性质进行比较研究,并对LPMO在天蓝色链霉菌几丁质降解过程中功能进行了同源验证,为LPMO的综合利用和生物质的高效降解提供指导,也为揭示LPMO的生物学功能奠定了基础。
【图文】：

图 1.1 LPMO 的分布和分类Figure 1.1 Distribution and classification of LPMOAA9 家族包含约 2500 个注释序列，其总体序列同源性偏低，系统发育分析进一步分为三个亚家族[25, 26]。序列同源性研究表明，，尽管大多数序列由单个结构域组成，但其中约 20％含有 C 端接头和 CBM1 模块，CBM1 模块是真素结合域。AA10 家族含有两个系统发育进化分枝，其区别在于它们对几丁质或纤维素异性[25]。Vu 等[27]认为，不同底物特异性的 AA10 酶之间具有活性位点差异 AA10 家族进一步分成两个亚家族，其中大部分 AA10 家族成员具有几丁性。AA10 家族同样具有 CBM，其结构的多样性比 AA9 家族更丰富[14]。已知的 AA11 家族序列包含了在 AA9 和 AA10 家族中所发现的活性位点特通过生物信息学分析进一步分成两个亚家族[28]，目前仅确定了其中较大一几丁质底物特异性[29]。Voshol等开展了基因组挖掘工作后，确定了AA14家族

图 1.2AA9 家族和 AA10 家族 LPMO 的蛋白结构图[14] Protein structure of early published LPMO of theAA9 family and cus aurantiacus 来源的 AA9 家族 LPMO，TaLPMO9A(TaGH61A的 AA10 家族 LPMO，SmLPMO10A(CBP21)；（C）（D）分别SmLPMO10A 的活性位点昆虫 Thermobia domestica（斑衣鱼）TdAA15A 的结构研的表面上有两个几乎共面的酪氨酸残基暴露出来，这个十分重要。此外，在许多 AA9 家族 LPMO 的组氨酸支架香族氨基酸残基，通常是酪氨酸（Tyr），而在 AA10 家具有几丁质底物特异性的 AA15 家族 LPMO，其蛋白结支架的苯丙氨酸残基。的模块化结构知 3D 结构的 LPMO 是单结构域的酶，但也有例外。如来霉）的 HjLPMO9A 以及来自 Aspergillus oryzae（米曲霉
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q55

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本文编号：2653917