ADAM17促进低氧条件下表皮细胞迁移的作用与机制研究

发布时间：2020-05-26 23:23

【摘要】：研究背景创面愈合是烧创伤的基本问题,而促进创面快速愈合是解决问题的关键。皮肤损伤后各种细胞会立即行动起来保护创面组织并促进愈合,这一过程的完成需要多组织,多细胞协调作用,其中再上皮化在创面愈合的全过程中都发挥着重要的作用。皮肤创面的再上皮化依赖于角质形成细胞的迁移、增殖、分化等多种因素的综合影响。研究表明创面损伤后由于大量细胞的活性被激活使得创面组织消耗大量的氧,导致创面处于低氧的微环境。且大量研究表明创面的低氧环境有利于表皮细胞的迁移和促进创面愈合的作用,然而其潜在的调节机制依然不清楚。ADAM17是多结构域跨膜金属蛋白酶,其对细胞的迁移,粘附和细胞信号具有调节作用。在皮肤发育和体内平衡过程中,ADAM17是调节许多细胞信号过程的基础。然而其在皮肤表皮中的作用机制还未揭示。大量研究表明在创面愈合过程中,p38/MAPK促进角质细胞的迁移,且p38/MAPK受到低氧的激活。有研究指出p38可以通过调节ADAM17的磷酸化调节ADAM17活性和表达进而介导ADAM17调节的细胞效应,那么在表皮细胞中ADAM17活性是否受到p38的调节进而促进细胞的迁移仍未可知。ADAM17作为跨膜金属蛋白酶家族的一员,其在细胞中主要通过裂解膜分子的胞外域的脱落调节细胞的生理过程。表皮生长因子受体EGFR在皮肤的创面愈合中发挥着重要作用,有研究表明在ADAM17敲除的小鼠表型与EGFR缺失的表型类似,指出EGFR是ADAM17的基本基底,且二者对共同维持皮肤的完整发育具有重要的作用。EGFR表皮生长因子受体作用的发挥主要受到其配体EGF家族的激活与调节。EGF家族包括多个分子,其中TGF-α、HB-EGF、AREG主要由ADAM17调节。但是在低氧条件下,表皮细胞的迁移是否受到ADAM17裂解释放EGFR配体的影响,此过程又是否受到p38/MAPK的调节,这一重要的调节机制目前依然不够明确。因此本研究将根据这一思路探究ADAM17在表皮细胞迁移中的作用机制。本研究提出低氧上调p38/MAPK信号途径并激活ADAM17活性促进EGF家族分子的释放,进而调控表皮细胞的迁移。通过检测低氧条件下ADAM17对表皮细胞迁移的影响,并探讨p38/MAPK对表皮细胞中ADAM17分子的活性及细胞迁移调节作用,从而明确ADAM17对低氧条件下促进表皮细胞迁移的作用机制。研究方法1.制作体外表皮细胞促进创面愈合的模型,模拟体内创面损伤时组织愈合的低氧微环境,观察常氧(21%O_2)和低氧(1%O_2:0h、6h、12h、24h)处理前后表皮细胞的运动性和迁移以及ADAM17蛋白的表达和活性以及基底EGFR配体的变化规律;2.分别通过TAPI-2抑制表皮细胞ADAM17的活性和通过si RNA转染技术沉默ADAM17蛋白表达,然后对处理后的表皮细胞进行划痕以制作创面愈合模型,并进一步将细胞放入低氧箱中模拟低氧环境(1%O_2)培养细胞相应的实验时间(12h),然后拍照统计细胞的创面愈合率和细胞的运动。本实验首先通过药物处理细胞并在特定的实验时间点收集细胞上清和提取总蛋白,然后分别用试剂盒和WB检测ADAM17的抑制剂TAPI-2和si RNA转染对其分子活性和蛋白表达的抑制及沉默作用;在处理后的实验时间点用显微镜记录单层细胞划痕实验模拟的细胞愈合状态,观察抑制ADAM17的分子活性对创面表皮细胞迁移的影响作用;另外,对处理过的表皮细胞在活细胞工作站下观察单个表皮细胞的ADAM17表达下调对细胞运动性的影响;总之,分别从ADAM17的活性水平和蛋白水平表明其对低氧条件下表皮细胞运动性的调控作用。3.分别用p38/MAPK的抑制剂SB203580和激酶MKK6处理表皮细胞,通过WB检测低氧(1%O_2:12h)处理前后表皮细胞中p-p38/MAPK表达及p-p38/MAPK的底物MK-2的磷酸化水平变化,并检测低氧条件下p38/MAPK下调和上调对表皮细胞ADAM17蛋白表达及活性的影响,最后通过划痕实验和单细胞运动实验检测低氧条件下p38/MAPK的抑制剂SB203580和激酶MKK6处理对表皮细胞运动性及迁移的影响,从而从细胞和分子两个层面表明低氧条件下ADAM17对表皮细胞迁移的调控机制。结果1.24h内不同时间的低氧处理都对表皮细胞的运动性具有明显的促进作用,并且低氧显著上调低氧转录因子HIF-1α的表达以及ADAM17的表达和活性,二者的表达规律成正相关;2.使用ADAM17的抑制剂抑制ADAM17的活性和其特异性小干扰siRNA沉默其蛋白表达,通过创面愈合模型划痕实验和单个细胞运动性实验发现ADAM17的下调可明显的抑制表皮细胞的的迁移,而且其可以对低氧促进的表皮细胞迁移作用有效的逆转,表明低氧促进的表皮细胞迁移受到解聚素金属蛋白酶分子ADAM17的调控作用;3.p38/MAPK的活性受到低氧的激活,低氧条件下用p38/MAPK的抑制剂SB203580和激酶MKK6处理表皮细胞,可以显著调节p38/MAPK的底物MK-2的磷酸化。并且和ADAM17的蛋白表达和活性也呈正相关。另外,抑制p38/MAPK的活性可以对低氧条件下的表皮细胞迁移产生显著的抑制作用,而激活可以增强低氧的促进作用。说明低氧条件下p38/MAPK通过促进ADAM17信号通路来促进表皮细胞的迁移。结论低氧促进表皮细胞中p38/MAPK信号通路的激活,并上调ADAM17的表达和活性,从而促进表皮细胞迁移;同时低氧通过低氧转录因子和p38/MAPK信号途径上调了ADAM17翻译水平的蛋白活性,但是转录水平基因的表达是否有变化仍未可知,而且有文献表明p38/MAPK可以磷酸化ADAM17的胞质区结构域,所以低氧条件下的p38/MAPK是否也通过这一信号途径,仍需要深入的探究。总之,本次的研究成果首次表明ADAM17在皮肤创面再上皮化中的作用,阐明其在表皮细胞迁移中的促进作用机制,为深入研究调控创面愈合的作用机制提供了新的研究思路,并为临床上治疗创面疾病,加速创面愈合,解决创面损伤并发症提供了新的可能治疗靶点。
【图文】：

形态图,细胞的,形态,细胞

第 1 章低氧对表皮细胞迁移及 ADAM17 表达及活性的影响验结果CaT 细胞培养结果aCaT 表皮细胞株接种于 25cm2的培养瓶，细胞悬浮在培养基中呈显的一圈光晕具良好的活性，然后将细胞静置于培养箱中，十分培养基底部轻微贴壁，十小时后细胞大多伸出触角半贴壁且呈半态，此时大部分细胞具扁平状，胞膜边界清楚，，核大,立体感较强小时后细胞完全铺展开，立体感变弱，贴壁紧固，折光性变强。殖迅速相互接触，细胞呈椭圆形，或者梭形,细胞增殖速度降低。图 1-1。

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结果显示随着低氧处理的时间延长细胞的迁移速率加快，创面愈合率也随着增加。如图1-2，统计不同条件处理细胞相同的时间的结果表明低氧条件下细胞的迁移明显的高于常氧条件下细胞的迁移，低氧处理的细胞创面愈合面积同样也大于常氧条件处理的细胞创面愈合面积（n=4,*P<0.05）。创面愈合面积=原始划痕面积-X 小时后创面的面积创面愈合率=创面愈合面积/原始划痕面
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q418

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