鸡干扰素调节因子7的体外表达及其单克隆抗体的研制
发布时间：2020-05-29 12:15
【摘要】：IRF7(Interferon regulate factor 7)是激活I型IFN基因转录和表达过程中起着关键性调节作用的IRFs家族成员,它参与机体的天然免疫和获得性免疫调控。在病原体入侵宿主时,宿主模式识别受体与病原相关分子模式相互作用,激活宿主不同的信号通路,磷酸化激活IRF7,使其从细胞浆转移至细胞核内并结合IFN的启动子,激活且释放IFN分子,随后JAK/STAT信号通路被激活,产生许多具有发挥抗病毒功能的ISGs,从而抵御病原体入侵。有研究发现,在哺乳动物中病毒可以通过阻碍IRF7生物学功能影响宿主抗病毒能力,从而完成自身在宿主中的复制,但是在禽类上有关于IRF7的生物学功能以及病毒是如何作用IRF7以逃避机体免疫反应的研究报道却很少,有关IRF7的很多问题亟待解决。本研究旨在通过构建chIRF7的原核和真核表达质粒,研制抗chIRF7单克隆抗体,为今后chIRF7在IFN信号通路中的作用、禽类疾病的基础性研究提供生物材料。主要研究内容和研究结果包括以下两部分:1.鸡干扰素调节因子7基因的克隆与表达为了获得鸡干扰素调节因子7(IRF7)的原核及真核表达质粒,本研究通过分离鸡外周血淋巴细胞,抽提RNA并将其反转录,获得鸡淋巴细胞cDNA,将其作为chIRF7基因扩增模板。根据GenBank上已发布的chIRF7基因序列设计合成两对特异性引物,应用聚合酶链式反应扩增获得chIRF7目的基因,将其分别克隆至原核表达载体pCOLD-TF和真核表达载体 pcDNA3.1-rIgG 中,构建成 pCOLD-TF-chIRF7、pcDNA3.1-chIRF7-rlgG 重组质粒。将测序正确的pCOLD-TF-chIRF7质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)感受态中,通过0.25mmol/L异丙基-β-D硫代半乳糖苷低温诱导20h,经SDS-PAGE和Western-blot验证,结果显示融合蛋白HIS-chIFR7能够获得表达,且分子量大小为107kDa左右,与预期目的蛋白大小一致。将测序正确的真核质粒经TransIT-LT转染入DF-1细胞,应用间接免疫荧光和Western-blot方法进行验证,结果显示重组的chIRF7蛋白在DF-1细胞中能够获得表达。chIRF7原核及真核重组质粒的获得为进一步研制抗chIRF7单克隆抗体提供了材料。2.抗鸡干扰素调节因子7单克隆抗体的研制为制备针对抗鸡干扰素调节因子7单克隆抗体,本研究用含原核表达蛋白产物HIS-chIRF7为免疫原,免疫6周龄BALB/c小鼠,每间隔10天免疫一次,第4次免疫结束后进行细胞融合。通过利用pcDNA3.1-chIRF7-rIgG真核质粒转染入DF-1细胞,并应用间接免疫荧光和Westerm blot方法对杂交瘤细胞上清进行筛选,结果获得4株能够稳定分泌抗chIRF7单克隆抗体的杂交瘤细胞株,将其分别命名为chIRF7-lF12、chIRF7-2B7、chIRF7-5A2、chIRF7-6G7。经过两次亚克隆,杂交瘤细胞达到100%分泌抗chIRF7特异性抗体。亚类鉴定结果表明chIRF7-lF12亚型为IgG2b,其余均为IgGl。通过构建5个chIRF7分段基因的真核质粒,分别转染入DF-1细胞并应用间接免疫荧光方法对4株单抗的抗原表位进行分析,结果表明 chIRF7-lF12、chIRF7-2B7、chIRF7-5A2、chIRF7-6G7 抗原表位分别位于chIRF7全长蛋白的36-115aa,184-247aa,36-115aa,142-182aa。应用间接免疫荧光方法对4株单抗腹水进行效价测定,结果表明4株单抗IFA效价均在1:128000以上。本研究成功制备了抗chIRF7单克隆抗体,为进一步研究chIRF7的表达调控机制及其在IFN信号通路中的作用奠定基础。
【图文】：
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本文编号：2686916
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