黑曲霉XZ-3S木聚糖酶XynZF-2分子改造及异源表达研究

发布时间：2020-06-03 12:50

【摘要】：背景木聚糖酶(Xylanase)[EC.3.2.1.8]在自然界分布广泛,是可以将木聚糖降解为低聚木糖和木糖的一组酶。木聚糖酶在酿酒、饲料、造纸、能源等领域广泛应用,工业应用对木聚糖酶的热稳定性要求较高,但是天然中温木聚糖酶热稳定性较差,对其分子改造提高热稳定性已成为迫切需要。目的1获得热稳定性提高的突变酶。2获得实验室水平的木聚糖酶基因工程菌最优发酵条件。3探索突变酶在枯草芽孢杆菌和毕赤酵母中的表达差异。方法1木聚糖酶基因生物信息学分析利用DNAMAN 6.0、NCBI BLAST对木聚糖酶基因xyn ZF-2进行同源序列比对分析,通过The Phyre2、DS ViewerPro 6.0、Prosite、ProScale等软件对酶分子的空间结构、分子理化性质以及分子间作用进行综合分析,确定酶的改造方案。2突变基因及表达载体构建利用重叠延伸PCR,全基因突变等方法获得目的基因,构建突变基因的毕赤酵母和枯草芽孢杆菌表达载体。3突变木聚糖酶诱导表达重组突变酶经过诱导发酵成功在毕赤酵母和枯草芽孢杆菌中表达。4突变酶酶学性质分析对重组工程菌的表达产物进行SDS-PAGE分析,DNS显色反应测定突变酶的最适温度、热稳定性、最适pH、pH稳定性、评估以上因素对酶活力的影响。5重组工程菌发酵条件的优化通过单因素试验,对重组工程菌产酶的发酵培养基、诱导温度、种龄、诱导时间、诱导初始pH、甲醇浓度等多方面发酵条件进行优化,并且结合正交试验和响应面分析综合实验,探索工程菌的最佳发酵条件。结果1木聚糖酶XynZF-2 C-端引入二硫键,构建大肠杆菌重组菌BL21(DE3)/pET-28a-xynZFTA;构建毕赤酵母重组菌GS115/pPIC9K-xynZFTA。2将EvXyn11 N-端的34个氨基酸替换木聚糖酶XynZF-2的N-端48个氨基酸,引入芳香族氨基酸P9Y和H14F,糖基化修饰位点E42N和F17S,C-端引入二硫键Cys38-Cys191、α-螺旋及cord区域引入疏水性氨基酸K164M、G166A、N160I及V111A、G109A,最后两个碱基(AA)替换成(GC),添加pPIC9K多克隆区域部分序列,设计杂合酶。获得工程菌GS115/pPIC9K-xyn ZL+实验室水平的最佳发酵条件:诱导温度29.4℃,诱导时间180 h,诱导初始pH5.5,诱导甲醇浓度1.16%。3 XynZFTA、XynZL+和XynZF-2分子量分别为24.10 kDa、24.60 kDa、24.10 kDa。4成功构建枯草芽孢杆菌重组菌WB600/pP43NMK-xynZF-2,表达出木聚糖酶。5 BL21(DE3)作为宿主,XynZFTA的最适温度比原酶(40℃)提高了10℃,在50℃保温5 min,突变酶残余的相对酶活性为55.36%,较原酶(32.62%)提高了22.74%。6 GS115作为宿主,XynZFTA和XynZL+最适温度分别提高了15℃和5℃,XynZFTA的t_(1/2)~(60℃)=9 min、XynZL+的t_(1/2)~(60℃)=10 min,原酶在此温度下失活;GS115/pPIC9K-xyn ZFTA、GS115/pPIC9K-xynZL+最适温度和最适pH分别是60℃、50℃和pH5.0、pH6.0。7 BL21(DE3)/xynZFTA、GS115/xynZFTA和GS115/xynZL+重组酶K_m分别为0.063、4.15和2.52,V_(max)分别为120μmoL/mL/min、350μmoL/mL/min和253μmoL/mL/min。结论1 C-端引入二硫键;多位点突变和修饰(N-端替换,糖基化修饰位点引入和在α-螺旋及cord区域分别引入疏水性氨基酸)可以提高木聚糖酶分子的热稳定性。2毕赤酵母作为宿主比大肠杆菌和枯草芽孢杆菌更有利于酶改造特性的体现。
【图文】：

标准曲线,木糖,标准曲线

4 2.0 0.4 0.5 2.5 0.6345 2.5 0.5 0 2.5 0.842图1 木糖标准曲线Fig.1 Standard curve of xylose1.12.2 蛋白标准曲线绘制蛋白质标准曲线的绘制见表15，量取不同体积的蛋白质标准液和蒸馏水加入5组不同的实验组，使终体积为100 μL，加入考马斯亮蓝染色液5 mL，混合均匀后室温放置5 min，，摇匀，使用紫外分光光度计测量在595 nm处的吸光值（每组3个平行试验组，y=2.1111x-0

标准曲线,酶活力,酶促转化,新乡医学院

新乡医学院硕士学位论文30取平均值），绘制标准曲线图（图2）。1.12.3 相关公式推导酶活力也称酶活性，即酶催化化学反应的能力。酶活力的大小可以用它在一定条件下催化的某一化学反应的转化速率来表示，即在酶的催化作用下，底物转化为产物的速率越快，酶的活力就越高，测定酶的活力就是测定酶促转化速率。表15 蛋白质标准曲线绘制Table 15 Standard curve of protein图2 蛋白质标准曲线Fig.2 Standard curve of protein酶活力公式由木糖标准曲线推导得出：试管号蛋白标准液（mL）蛋白含量（mg）蒸馏水（mL）考马斯亮蓝（mL） A5950 0 0 0.10 5 01 0.01 0
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78

【相似文献】