利用转座子插入突变文库研究杀鱼爱德华氏菌代谢和毒力互作机制

发布时间：2020-06-07 10:42

【摘要】：转座子是存在于染色体上的一段可移动的DNA。基于已经成熟的Mariner家族Himar1转座子pMAR2×T7,我们设计并改造成满足特定需求的转座子pMKGR。pMKGR携带庆大霉素抗性标签和mCherry红色荧光标签,也携带无启动子的EGFP和卡那霉素阅读框,识别TA碱基位点并且插入染色体。以杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)为模式菌,成功构建了包含20,668个插入位点确定的突变株文库。该文库覆盖杀鱼爱德华氏菌全基因组(编码3,599基因)中2,806个基因,覆盖率为78.0%。根据文库的分析数据和中性碱基模型,我们预测杀鱼爱德华氏菌大约有464个必需基因。针对文库不同的筛选目的,在文库的基础上构建了 5个不同的子库,利用5个子库进行了体内外毒力相关基因的筛选。Tn-seq筛选结果显示,杀鱼爱德华氏菌毒力表达与其代谢状态密切相关,尤其是甘露糖代谢和脂肪酸代谢,相关基因的突变导致该菌的体内存活能力显著降低。对于甘露糖代谢,E.piscicida通过ManXYZ催化甘露糖生成甘露糖-6磷酸(Man-6P),经ManA催化进一步生成果糖-6磷酸(Fru-6P),参与糖酵解过程。我们发现,甘露糖代谢产物Man-6P可以通过直接结合DeoR家族转录调控因子ETAE_2071(EvrA),调控三型分泌系统(T3SS)以及六型分泌系统(T6SS)表达。实验证实,EvrAR141和EvrAR221是和Man-6P相互作用的关键氨基酸。突变这两个氨基酸后,EvrA不能感受并结合甘露糖,进而关闭esrB的表达。在考察脂肪酸和T3/T6SS表达之间关系时,我们发现E.piscicida体内不饱和脂肪酸含量和T3SS显著负相关(R2=0.981)。实验发现,游离长链单不饱和脂肪酸(UFA)可以直接与EsrC相互作用,使EsrC失去结合DNA的能力,最终关闭T3/T6SS的表达。通过对EsrC蛋白结构的模拟分析,发现EsrC和UFA直接作用的关键氨基酸为EsrCR38。在E.piscicida感染宿主和成功定植过程中,UFA扮演了更为重要的角色。UFA不仅动态调控了杀鱼爱德华氏菌T3/T6SS毒力系统的表达,而且促进了宿主细胞内脂滴(Lipid droplet,LD)的大量形成,进一步介导炎症反应,清除病原菌。在宿主细胞中,多余的脂肪酸主要以甘油三酯和胆固醇酯的形式储存在LD细胞器中。细胞中LD的含量与不饱和脂肪酸含量线性相关。E.pisciciEa感染宿主细胞的过程显著降低了宿主细胞中LD的含量,E.piscicida ΔT3SS感染过程却显著激活了宿主体内SCD1表达,促进了LD形成。E.piscicida T3SS对宿主细胞中UFA/LD合成的抑制不依赖于T3SS针状结构,而依赖于T3SS效应物。UFA显著抑制了EE.piscicida在HeLa细胞中定植,E.piscicida在SCD1-/-细胞中的定植水平显著高于在野生型HeLa细胞中的定植水平。在E.piscicida感染斑马鱼过程中,外加油酸显著提高了斑马鱼的存活率,SCD1-/-斑马鱼显示出对E.piscicida更高的敏感性。UFA/LD既能抑制病原菌毒力表达,又能激活宿主免疫响应,以抵抗和清除外来的病原菌。因此,UFA/LD在抵抗E.piscicida感染宿主方面发挥了重要作用。在自然界中,病原菌利用自身代谢物或者宿主体内代谢物作为信号调控毒力表达是病原菌适应复杂多变体内外环境的一种重要策略。本课题利用转座子插入突变文库为工具,以E.pipscicida为模式菌,研究病原微生物代谢和毒力互作关系。本研究为水产病原防治和水产养殖提供重要的指导。
【图文】：

１．１．１杀鱼爱德华氏菌概述逡逑爱德华氏菌（及属于肠杆菌科，革兰氏阴性菌，短杆状，具有周生鞭毛［１］逡逑（图１．１Ａ）。爱德华氏菌是一种重要的鱼类致病菌，能对大菱鲆、鲶鱼、鳗鲡和斑马鱼等逡逑２０多种淡水和海水鱼类致病，引起出血性败血症，造成大量鱼类死亡，严重危害水产养逡逑殖业［２－５］（图１．１Ｂ，Ｃ）。最初于１９６２年，杀鱼爱德华氏菌从日本鳗逡逑鲡中分离得到；１９６５年，Ｅｗｉｎｇ等将这一类细菌命名为迟缓爱德华氏菌（及／ｎｗＹｆｏＷ／ｆｌ逡逑ｔｏ油）［６，７］；邋２０１３年，Ａｂａｙｎｅｈ等对迟缓爱德华氏菌中的菌株重新分类，将来自人类排泄逡逑物与来自鱼体的菌株区分开，组成新的种为杀鱼爱德华氏菌（￡．／＾ｃｚ＿ｄｔ／ａ）［８］。２００６年，本逡逑课题组从山东烟台患病大菱鲆中分离得到杀鱼爱德华氏菌强毒株Ｅ逦办ＥＩＢ２０２［２］。逡逑五．ｐＷｃ油可在１５？４２°Ｃ温度范围内生长，适宜ｐＨ范围５．５？９．０［２］。逡逑２０１４年，，本课题组通过多位点序列分型与分析技术（ＭＬＳＴ与ＭＬＳＡ）对爱德华氏菌逡逑菌属重新进行了生物学分类Ｐ

２页逦华东理工大学博士学位论于水产养殖业的发展和人类健康有重要意义。逡逑１．１．２杀鱼爱德华氏菌的主要毒力系统逡逑１．１．２．１三型分泌系统逡逑三型分泌系统（Ｔｙｐｅ邋ＩＩＩ邋ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ邋ｓｙｓｔｅｍ，邋Ｔ３ＳＳ）广泛地编码于革兰氏阴性病原菌体内是细菌向外界环境或者宿主细胞注射效应蛋白的针筒状复合结构（图１．２Ａ，Ｂ）。携带Ｔ３Ｓ的病原菌，主要包括沙门氏菌志贺氏菌0Ｓ７７／ｇｖ？／／ｏｓｐｐ．）、鼠疫耶森菌霍乱弧菌（附／／？0邋ｃ／ｗ／ｅｒａｅ）、百曰咳博德氏菌（ＳｏｒｆｉｆｅｅＺ／ａｐｅｎｔｏｓ／ｓ１）铜绿假单胞菌（Ｐｓｅｗｃ／ｏｍｏｍｗ邋ａｅｒｕｇ７＞７0５’ａ）。关于Ｔ３ＳＳ的起源一直存在争论，但是目前遍认为Ｔ３ＳＳ由鞭毛组装元件进化而来［Ｗ。在向胞外分泌鞭毛组装的元件蛋白过程中鞭毛组装所依赖的蛋白分泌机制和Ｔ３ＳＳ有很多共同之处［１５１邋（图１．２Ｃ）。逡逑
【学位授予单位】：华东理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;S941.42

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本文编号：2701294