慢病毒介导的人p53基因过表达及稳定感染细胞系的建立

发布时间：2020-06-18 01:20

【摘要】：p53基因作为肿瘤抑制的关键基因,主要功能是修复与细胞周期G、S期有关的DNA损伤,并且在DNA损伤严重时诱导受损细胞的凋亡。因此,p53基因在维持基因组的稳定与预防癌症发生方面具有重要的作用。在等摩尔比例下,具有正确DNA结合结构域的野生型p53蛋白比突变型p53蛋白活性更强,野生型p53蛋白不仅可以抑制突变型p53蛋白的获得性功能,而且可以诱导由突变型p53蛋白引起的肿瘤细胞的凋亡。由于在所有恶性肿瘤中,该基因的突变率在50%以上。因此,p53基因及其表达产物可以起到预防肿瘤细胞发生和发展的重要作用。本研究设计并构建了两种慢病毒表达载体pWPI-p53WT-Neo和pWPI-PTEN-Neo,并将上述两种慢病毒载体和包装质粒(packaging plasmids)组成的包装系统共转染293T细胞,收集慢病毒颗粒并测定pWPI-p53慢病毒和pWPI-PTEN慢病毒的滴度。按实验设计流程将两种病毒感染靶细胞CF-1,利用G418筛选出稳定细胞系后收集细胞内蛋白质样品。然后,通过Western Blot实验对收集到的CF-1-p53细胞和CF-1-p53-PTEN细胞内的蛋白质样品进行检测。实验结果表明慢病毒介导的人p53基因在CF-1细胞系中能够过表达p53蛋白,并且慢病毒介导的人p53基因和PTEN基因共同导入CF-1细胞系中也能过量表达p53蛋白,但是与慢病毒介导人p53基因的单独导入CF-1细胞相比产生的p53蛋白较少。上述实验结果证明本研究成功建立了人p53基因稳定表达细胞系。本研究还通过细胞计数法检测p53基因和PTEN基因表达后对细胞生长的影响。实验结果发现慢病毒介导的人p53基因的导入会对CF-1细胞的生长产生抑制作用,而慢病毒介导的人p53基因和慢病毒介导的PTEN基因的同时导入同样会对CF-1细胞的生长产生抑制作用,并且抑制细胞生长的程度比慢病毒介导的人p53基因单独导入的细胞更加强烈。上述实验结果表明,CF-1-p53-PTEN细胞系较CF-1-p53细胞系中p53蛋白的过表达量少,可能是因为PTEN基因与p53基因的同时过表达对细胞生长的抑制作用引起的。综上所述,本论文成功构建了慢病毒表达载体pWPI-p53WT-Neo和pWPI-PTEN-Neo,并利用G418筛选出pWPI-p53慢病毒和pWPI-PTEN慢病毒感染的稳定细胞系CF-1-p53和CF-1-p53-PTEN。通过Western Blot实验成功检测到两种细胞内p53蛋白的过量表达,并且利用细胞生长曲线的测定证明p53和PTEN基因的过量表达对CF-1细胞生长的影响。本论文为利用p53基因治疗癌症提供了重要的实验基础。
【学位授予单位】：山东师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78
【图文】：

得分别含有 p53 基因和 PTEN 基因的目的基因片段。PIRES-EGFP-p53WT 质粒结构如图 2-1所示。图2-1 PIRES-EGFP-p53WT质粒图谱Figure 2-1 PIRES-EGFP-p53WT plasmid map

山东师范大学硕士学位论文15图2-2 pWPI-hPLK2WT-Neo载体图谱Figure 2-2 pWPI-hPLK2WT-Neo vector map表2-3 pWPI-hPLK2WT-Neo质粒酶切反应体系Table 2-3 pWPI-hPLK2WT-Neo plasmid digestion reaction systempWPI-hPLK2WT-NeoEB buffer 0 μL10×3.1 buffer 20 μLplasmid 175 μLBam HI 5 μLTotal 200 μLpWPI-hPLK2WT-Neo 质粒酶切反应条件为：37℃反应 2 h，65℃反应 20 min。1.0％琼脂糖电泳后，回收酶切片段。

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本文编号：2718465