ADAM23基因在斑马鱼胚胎发育过程中的功能研究

发布时间：2020-06-21 19:26

【摘要】：去整合素和金属酶蛋白(A Disintegrin And Metalloprotease,ADAM)家族是一类膜锚定蛋白,由信号肽、前体蛋白、金属蛋白酶域、去整合素域、半胱氨酸富集域、类表皮因子结构域、跨膜域和胞质尾区组成,目前发现三十四个成员,在人类和小鼠中ADAM蛋白在许多组织中广泛表达。研究表明该蛋白家族成员参与了细胞与细胞,细胞与基质之间的相互作用,涉及受精,神经细胞发育以及肿瘤细胞迁移等生理过程。ADAM23是ADAM家族的成员之一,具有ADAM家族完全相似的结构,其蛋白大小约75kDa,在中枢神经系统广泛表达。在1998年从鼠的细胞中克隆出ADAM23的同源基因,该基因表达的蛋白在人与鼠之间高度保守,随之从人类基因组中克隆出ADAM23基因,对其蛋白序列进行分析表明该蛋白质缺乏金属蛋白酶活性而去整合素结构域高度保守,说明其功能可能是作为细胞表面受体与整合素相结合。文献报道ADAM23基因对大脑发育有着重要影响,在神经元的迁移与伸长到运动与感知系统的功能中均扮演了一定的角色,ADAM23敲除小鼠表现出癫痫症状。同时ADAM23基因的沉默对各种癌症的发生也有着密切关联,其与整合素的结合复合物能够改变细胞粘附力,该功能的缺失影响到癌细胞的迁移与分化。但这些研究大部分是在细胞水平进行,在体内研究较少,尤其是该基因对斑马鱼胚胎的发育过程的影响还没有报道。斑马鱼为脊椎动物,与人器官在结构、生理和分子水平等都极其相似,其胚胎呈透明状,可以观察内部器官和系统的发育情况,非常适合作为研究发育过程的模式生物。通过BLAST人源氨基酸序列确定了在斑马鱼中该基因只有一个同源序列adam23a,有很高的保守性,保守性为75%,且在斑马鱼胚胎多达17种组织器官中均表达。目前对ADAM23基因在斑马鱼中的研究比较少,仅有报道该基因表达蛋白作为与LGI1结合的受体,两者相互作用调节突触传递的强度,暗示着ADAM23参与了大脑的发育及复杂功能。因而对于该基因除了其受体作用,其在斑马鱼发育过程中是否有其他重要影响,这都是未知的。本课题选择斑马鱼为实验动物,通过显微注射技术将ADAM23-W mRNA和mCherry mRNA为对照注射进斑马鱼1-2细胞期的胚胎,收集各发育时期的胚胎,再用整体原位杂交技术观察高表达ADAM23后各组织标志性基因的表达是否有差异。我们重点研究了ADAM23基因是否对斑马鱼胚胎骨骼,肌肉,神经系统和心血管系统发育的影响。我们在每种组织中选择多个发育标志性基因的探针来检测其发育状态,包括肌肉标志基因mlc2f,smyhc1,myf5和mef2ca和myogenin骨骼标志基因sox9a,osterix,dlx2a和col1a1a,神经发育标记基因eve1,elavl3,shha,krox20和neurog1以及血管标志基因etsrp,fli 1,cmyb和runx1。原位杂交结果显示该基因对斑马鱼的肌肉标志基因myogenin、骨骼标志基因dlx2a和col1oala和神经系统标志基因neurog1的表达量均有影响且均呈现上调作用,这些结果表明ADAM23基因可能参与了斑马鱼肌肉、骨骼及神经系统的发育过程,对斑马鱼胚胎发育有重要调控作用。我们的结果首次发现ADAM23基因调控斑马鱼胚胎发育,尤其是对肌肉、骨骼及神经系统的发育具有重要作用。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4
【图文】：

神经原,早期形态,图片,神经突

的过程（图片参考于文献[10]）。A 是神经突，C 是神经突腔化形成神经管enesis of neuronal primordium[10].Akeel and C is neural rod .进入快速成熟阶段，神经原节沿为端脑（telencephalon），间脑呈箭头形的是正在发育的眼原基[基一起扩张，而松果体（epiphys中脑原基水平分裂形成背侧中脑中-后脑边界区域显著，底板从也由脑和脊索外侧迁移发育，随听觉原基覆盖于后脑以及与视觉

质粒图谱,质粒,恒温培养箱,后放

图 2.4.2 pCS2+-ADAM23-W 质粒图谱Fig.2.4.2 Map of pCS2+-ADAM23-W plasmid2.4.3 制备 mRNA（1）将测序正确的质粒进行线性化，选取 NotⅠ为酶切位点，酶切体系如下：10×H 4 μL0.1%BSA 1 μL0.1%Trion X-100 4 μLNotⅠ enzyme 4 μL质粒 2 ngddH2O 补至 40 μL吹打混匀后放在 37℃恒温培养箱酶切 6 小时；

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