原核生物Argonaute（pAgo）蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究

发布时间：2024-07-09 05:50

　　虽然经典遗传操作工具在少数模式细菌中有着很好的效果,但并不适用于大多数重要病原菌在内的其它细菌。新型基因编辑技术CRISPR/Cas9由于存在表达元件复杂、脱靶效率高以及细菌存在抗Cas9分子等因素,限制了该技术在很多病原菌中的应用。因此,开发通用、简便、高效、无痕的遗传操作工具对于病原菌致病机制和防控技术的研究具有重要的价值和意义。多杀性巴氏杆菌对猪、牛、鸡、鸭等畜禽养殖业危害严重,缺乏高效的遗传操作工具极大限制了该病原菌致病机理的研究及防控产品的研发。为了研究禽多杀性巴氏杆菌的致病机理和基因工程疫苗,我们实验室前期应用多种经典遗传操作系统,如温敏自杀系统、Sac B筛选系统、galk筛选系统及thy A筛选系统等,来构建禽多杀性巴氏杆菌基因缺失突变株但都未成功。后来采用NgAgo/gDNA系统成功实现了禽多杀性巴氏杆菌和兔多杀性巴氏杆菌靶基因的敲除和敲入,并获得了毒力下降的疫苗候选菌株,说明NgAgo/gDNA系统为多杀性巴氏杆菌致病机制和防控产品的研究提供了遗传操作工具,但该系统介导细菌基因组编辑的分子机制并不清楚。鉴于此,本论文主要研究原核生物Argonaute(pAgo)蛋白...

【文章页数】：209 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图1Tn5转座机制

原核生物Argonaute(pAgo)蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究3BarbaraMclintock在玉米中发现转座子以来(GierlandSaedler1992)，转座子作为重要的插入突变剂或分子标签广泛应用于细菌、真菌和其它微生物功能基因组研究中，成为重要病原菌等微生物....

图2溶血巴氏杆菌aroA突变株的构建

华中农业大学2020届博士研究生学位论文10春等人采用同样方法将Kan抗性基因表达盒与aroA基因替换，成功获得了毒力减弱的兔多杀性巴氏杆菌aroA突变株(郭冬春等2012)。Xiao等人利用该技术将禽多杀性巴氏杆菌phoP基因替换为kan抗性基因而快速获得突变株(Xiaoeta....

图3利用SacB筛选系统构建幽门螺杆菌vacA基因缺失突变株的策略

导入幽门螺杆菌株中；其次，利用Kan抗性筛选出kan-SacB盒与vacA基因发生同源交换的菌株，即kan-SacB盒替代vacA基因的菌株；最后电转入有vacA左右同源臂的空载质粒，在有5%蔗糖以及无Kan的条件下迫使kan-SacB盒与....

图4galK筛选系统的方案

原核生物Argonaute(pAgo)蛋白介导细菌基因组编辑及其机制研究13大片段人工染色体BAC提供了遗传操作工具，但是该系统必须要把galK插入到细菌染色体中，才能进行下一步的筛选过程，导致该系统使用时较为复杂，耗时较长。图4galK筛选系统的方案。Fig.4Theschem....

本文编号：4004494