GMFB与CNTN-1相互作用及GMFB在神经功能中的初步研究

发布时间：2020-06-25 03:50

【摘要】：研究背景哺乳动物的中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)损伤之后,自身修复和再生能力非常有限,给哺乳类动物带来沉重打击,会直接造成自身运动和(或)感觉功能的障碍,甚至产生致命的后果,目前还没有有效的治疗手段,本研究旨在从一个方面为哺乳动物的CNS损伤后自身修复和再生能力提供新思路。CNS损伤后之所以自身修复和再生能力极差,其中一个很重要的原因就是胶质细胞增生最终导致胶质瘢痕的形成,它成为了神经自身修复和再生的一道机械屏障。神经胶质细胞成熟因子β(Glial cell Maturation Factor β,GMFB)在物种间高度保守,但功能不明确。国内外对GMFB的研究,发现其主要在哺乳动物的星形胶质细胞和部分神经元中表达,促进神经细胞生长分化,有报道在低温脑损伤、乙醇损伤后,GMFB在脑星形胶质细胞中表达上调,此外,还有报道GMFB还参与了帕金森病以及自身免疫性疾病的病理过程,但具体机制不清楚。因此对GMFB功能的研究,将为哺乳动物中枢神经的再生机理研究提供重要的思路。接触蛋白(contactin-l,CNTN-l)是免疫球蛋白超级家族接触蛋白亚组的成员之一,在各种不同的神经组织中差异表达,主要存在于细胞浆,已有文献表明,CNTN-1主要功能有:促进神经轴突的生长,影响神经元纤维方向;CNTN-1突变型小鼠的小脑体积缩小25%,神经元的平行纤维方向紊乱,同时伴有严重的运动功能缺陷,如共济失调。大脑发育早期,CNTN-1可以促进脑室下区的神经前体细胞增殖;在肺腺癌细胞中研究也表明,CNTN-1对于侵袭功能和细胞肌动蛋白的骨架重塑以及局部粘附结构是必需的。CNTN-1这些研究报道与我们在斑马鱼中发现的GMFB缺失后端脑神经纤维丝变粗、变短和缺乏方向性有一定的联系,提示两者在脑中功能相似,可能共同参与了神经元的增殖、分化和细胞骨架重塑。研究目的明确GMFB与CNTN-1之间有无直接结合及在神经功能中的作用。研究方法1.免疫荧光染色和免疫组化染色采用免疫荧光染色技术和免疫组化染色技术,分别观察GMFB和CNTN-1在小鼠大脑皮层中的表达,以及观察GMFB和CNTN-1是否存在共表达。2.原代星形胶质细胞培养及鉴定用出生24h的SD乳鼠,在体视显微镜下操作,取出脑组织置于培养基上,用显微镊夹去小脑,再小心撕去软脑膜,剔除小血点和海马。将脑组织剪碎,过滤,最后置于培养基中,37℃,5%CO2培养箱环境中培养原代培养星形胶质细胞,4周成熟后,纯度鉴定通过GFAP免疫荧光染色,阳性率达到95%,满足实验要求,备用。3.免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)使用BeaverBeadsTM Protein A(or A/G)免疫沉淀磁珠及试剂盒(Beaver,苏州),抗原样品制备,磁珠预处理后与抗体工作液混合,进行抗体结合反应;再加入制备好抗原标本进行抗原沉淀反应;最后进行抗原洗脱,进行磁性分离,收集上清液,然后通过SDS-PAGE进行检测蛋白质复合物。4.质谱分析(Mass Spectrometry,MS)我们通过免疫共沉淀技术,将与GMFB抗体结合的沉淀物即蛋白复合物,进行质谱分析,发现与GMFB共同沉淀的具体蛋白质,并进行分析。5.CRISPR/Cas9技术采用CRISPR/Cas9技术,制备敲除GMFB基因小鼠,为研究哺乳动物GMFB作用机制奠定基础。6.普通PCR采用Premix Taq,TM试剂盒(TAKARA)将提取的DNA进行PCR,将PCR产物跑琼脂糖凝胶电泳,最后在凝胶成像分析系统下拍照读取结果,鉴定小鼠的基因型。7.实时荧光定量PCR采用Trizol试剂盒(TAKARA)从大脑组织中提总RNA;采用Prime Script TM试剂盒(TAKARA)将提取的总RNA通过逆转录生成cDNA;采用SYBR(?)Premix EXTaq TM试剂盒(TAKARA)定量检测GMFB和CNTN-1 的相对表达水平,以GAPDH作为参照。8.Western Blot采用RIPA缓冲液(凯基生物,南京)从小鼠大脑组织标本中提取总蛋白,通过SDS-PAGE蛋白电泳,孵育GMFB和CNTN-1抗体,检测GMFB和CNTN-1的表达情况。9.Morris水迷宫实验分别设计了航行定位实验和空间搜索实验,通过分析逃避潜伏时间和小鼠在平台象限停留时间,评估野生型组和敲除组小鼠的空间学习和记忆能力。10.高架十字迷宫实验通过高架十字迷宫实验,分析小鼠进入开放臂的次数(open arm entry,OE)和小鼠在开放臂停留时间(openarmtime,OT),评估小鼠情绪焦虑反应。研究结果1.GMFB和CNTN-1在小鼠大脑皮层细胞质中共表达我们分别在组织水平和细胞水平采用了免疫组化染色和免疫荧光染色,首先观察了小鼠大脑皮层中GMFB和CNTN-1的表达;然后通过培养原代星形胶质细胞,观察GMFB和CNTN-1在星形胶质细胞中的表达。结果提示GMFB在细胞核和细胞质均有表达;CNTN-1在细胞质中表达;GMFB和CNTN-1在细胞质有共表达。2.GMFB和CNTN-1存在相互作用我们通过免疫共沉淀技术,将与GMFB抗体结合的沉淀物,首先进行考马斯亮蓝染色,发现了有新蛋白复合物的存在,然后将GMFB沉淀物进行质谱分析,我们发现在小鼠大脑内,与GMFB共同沉淀的蛋白包括:肌动蛋白(actin),微管(tubulin),和CNTN-1。综上,GMFB与CNTN-1之间存在相互作用。3.pENTER-GMFB质粒和pcDNA3.1-CNTN-1-myc-His(-)质粒的构建首先提取小鼠大脑组织的总RNA,经逆转录成cDNA,用特异性引物进行序列扩增,再用相应酶切空质粒和序列,然后结合,转化到大肠杆菌中,经PCR法、酶切法检测后,挑取阳性克隆测序,测序正确的命名。成功构建了pENTER-GMFB质粒和pcDNA3.1-CNTN-1-myc-His(-)质粒。4.GMFB基因敲除小鼠的成功制备采用CRISPR/Cas9技术,再通过对PCR产物大小的检测,鉴定小鼠的基因型。成功获得GMFB(-/-)小鼠5只,GMFB(+/-)小鼠13只。5.GMFB基因敲除小鼠空间学习、记忆能力和焦虑情绪反应无明显变化通过Morris水迷宫和高架十字水迷宫实验发现GMFB基因敲除小鼠空间学习、记忆能力和焦虑情绪反应无明显变化。结论本研究明确了 GMFB与CNTN-1在小鼠大脑皮层细胞质中共表达,并存在相互作用;GMFB敲基因小鼠的成功制备;GMFB基因敲除小鼠空间学习、记忆能力和焦虑情绪反应无明显变化。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q42
【图文】：

编号原则,小鼠

图１．２．４ａ实验中小鼠编号原则逡逑Ｆｉｇ．ｌ．２．４ａ邋Ｔｈｅ邋ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ邋ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ邋ｏｆ邋ｍｉｃｅ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ逡逑ＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９邋技术逡逑用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技术（图１．２．４ｂ），利用非同源重组修复引入突变ＧＭＦＢ基因蛋白读码框移码，功能缺失。通过体外转录的方式，获Ａ和ｇＲＮＡ；将Ｃａｓ９邋ｍＲＮＡ和ｇＲＮＡ显微注射到Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠的得代小鼠。经ＰＣＲ产物测序确认，共获得９只目的基因蛋白Ｈ）代小鼠；Ｆ０代小鼠与Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠交配获得２个品系，共计７小鼠。Ｆ１代小鼠子自交获得Ｆ２代小鼠，共１个品系，经ＰＣＲ产证，其中阳性杂合子小鼠１３只，阳性纯合子小鼠５只。逡逑

小鼠大脑,野牛,免疫荧光染色,皮层

逦颂士学位论文逦逡逑结果逡逑２．１逦ＧＭＦＢ和ＣＮＴＮ－１在小鼠大脑皮层细胞质中共表达逡逑我们分别在组织水平和细胞水平采用了免疫荧光染色技术和免疫组化技术逡逑染色，首先观察了小鼠大脑皮层中ＧＭＦＢ和ＣＮＴＮ－１的表达；然后通过培养原逡逑代星形胶质细胞，观察ＧＭＦＢ和ＣＮＴＮ－１在星形胶质细胞中的表达。逡逑２．１．１逦ＧＦＶ１ＦＢ在细胞核和细胞质中均有表达逡逑分别通过免疫荧光染色（图２．１．１ａ）和免疫组化染色（图２．１．１ｂ），观察ＧＭＦＢ逡逑在小鼠大脑皮层中的表达，结果提示ＧＭＦＢ在胞核和胞质中均有表达（图逡逑２．１．１ａ，ｂ）邋0逡逑

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