基于植物病毒外壳蛋白靶标的药剂筛选与作用机理研究

发布时间：2020-06-27 23:18

【摘要】：近年来,植物病毒病害在农业生产过程中给农产品质量和数量带来了巨大损失,其中以马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)引起的病毒病害尤为严重。虽然目前对该病害的基础研究有所进展,市面上也有少数几种药剂能有效地治理该种病害,但其具体的作用机理尚不清楚,导致研发针对该病原体的特效性药剂难度极大。如何有效地筛选抗PVY药物是防治马铃薯病毒病害的关键问题,因此建立一个以PVY关键蛋白为潜在靶标的药物筛选模型,寻找高活性的抗PVY药物,对防治马铃薯病毒病具有重要意义。本论文以原核表达纯化的马铃薯Y病毒外壳蛋白(Coat protein,CP)为靶标,利用等温量热滴定法、微量热泳动法、农杆菌介导法和蛋白免疫印迹法研究PVY-CP与抗病毒小分子之间的相互作用,测得PVY-CP与抗病毒小分子之间的结合常数、结合位点数及主要作用形式。以药物与PVY-CP的作用力为指标,进行离体水平的抗PVY药物筛选。后续通过突变体蛋白和活体植株的两种验证实验初步探究药剂的作用机理,建立了基于PVY-CP为潜在靶标的药物筛选模型。研究结果表明,在体外,病毒唑、盐酸吗啉胍与PVY-CP均有不同程度的结合力,其结离常数大小为病毒唑(4.56μM)盐酸吗啉胍(77.6μM),而氨基寡糖、苯并噻二唑与PVY-CP没有相互结合;继而研究了杨梅素衍生物与PVY-CP的相互作用,结果表明LP4、LP6、LP9和LP17与PVY-CP均有不同程度的结合力,其中LP6和LP9与PVY-CP的结合力比LP4和LP17与PVY-CP的结合力强。通过突变体蛋白的验证实验明确了病毒唑与PVY-CP的结合位点为精氨酸(R)153、精氨酸(R)179、天冬氨酸(D)197和赖氨酸(K)217。通过活体验证实验表明了病毒唑对PVY-CP在活体植株内的表达有抑制作用。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S432.41
【图文】：

实验技术路线

4.1 pET28a-PVY-CP(wt)重组载体的酶切验证道 1:pET28a-PVY-CP(wt) 重组载体双酶切；pET28a-PVY-CP(wt) recombinant vector digestLine 1, pET28a-PVY-CP(wt)plasmids were digrs negative control. 1 和泳道 2 可以看出，双酶切后产生了带，可以看出说明 pET28a-PVY-CP(wY-CP(wt)重组载体的测序鉴定重组成功的重组质粒送到上海生工生结果与 NCBI 中已经提交的序列进行比列与其他已提交的基因序列（GenBank（图 4.2）。所有结果均可证明，构建的

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本文编号：2732237