七鳃鳗LIP蛋白晶体结构解析和相关位点突变的活性鉴定

发布时间：2020-06-28 08:49

【摘要】：七鳃鳗属于原始的无颌类脊椎动物,是研究免疫起源与进化的重要模式生物。本实验室发现七鳃鳗体内存在一种具有细胞毒性作用的蛋白分子,并命名为LIP(Lamprey Immune Protein)蛋白。现已比较深入的了解到这种独特蛋白的信息及功能,比如对多种癌细胞具有强烈的杀伤活性,并且对于正常细胞没有杀伤现象,以及从多个角度证实了LIP蛋白能够损伤肿瘤细胞的细胞膜和细胞器,并明确了LIP蛋白作用肿瘤细胞的信号通路等,这就为LIP能够作为治疗肿瘤药物提供了实验基础。天然活性的LIP蛋白是否有翻译后修饰现象至今未知。本研究通过DIA蛋白质组学定量技术检测到LIP蛋白存在多种不同的修饰方式,在Asn286具有N-糖基化残基修饰,在Ser295具有O-糖基化残基修饰,为检测糖基化位点的作用,将这两个氨基酸均突变为Ala称为第一号突变体LIPN286A和第二号突变体LIPS295A。为能够深入探究LIP空间结构方面的信息,随后解析LIP蛋白结晶结构,通过数据收集、相位解析、分析数据后建模得出LIP蛋白结构为P4_32_12空间群,分辨率为44.5~2.25?。LIP中存在一个与甘油分子稳定结合的氢键网络,并发现Asp135残基位于与配体结合的最中心位置,遂将这个氨基酸残基突变为Ala作为第三号突变体LIP~(D135A),进而确定这个残基位点对LIP的空间构造是否具有重要作用。LIP晶体结构解析还显示其具有Jacalin-like和Aerolysin两个结构域,将LIP通过与其结构类似的斑马鱼气单胞菌家族蛋白Dln1(Danio rerio aerolysin-like protein 1)同源建模后,发现二体相互作用面上的Met158、Phe229和Pro163、Phe227残基彼此能够形成氢键,将这四个氨基酸突变成半胱氨酸,期望在突变体中形成二硫键,此作为第四号突变体LIP~(M158C-F229C)和第五号突变体LIP~(P163C-F227C)。氨基酸序列比对和疏水性分析表明,LIP的一段氨基酸链(Phe209至Gly232)可形成两个含有疏水亲水残基的两亲性β链,遂将这一氨基酸链去除作为第六号突变体LIP~(Ser212-Ala238)。通过圆二色谱和荧光光谱检测LIP蛋白及六种突变体蛋白二级结构,发现它们都是以β片层为主,除突变体LIP~(Ser212-Ala238)变得更亲水外,其它突变体二级结构没有较大差异。LDH检测细胞活力实验发现突变体LIP~(D135A)、LIP~(M158C-F229C)和LIP~(P163C-F227C)不能与癌细胞膜表面特异性结合并丧失了杀伤作用,结果说明二体相互作用面上彼此形成氢键的Met158、Phe229和Pro163、Phe227残基和氢键网络中心的Asp135残基对于LIP蛋白特异性识别并杀伤癌细胞有重要作用;而LIP和LIP~(S295A)蛋白对MCF-7细胞显示明显的杀伤作用,在免疫荧光检测结果中LIP、LIP~(N286A)和LIP~(S295A)蛋白均定位于HeLa细胞的细胞膜上,并且呈现荧光颗粒状。免疫印迹结果显示LIP、LIP~(N286A)和LIP~(S295A)蛋白以多聚体形式存在细胞膜上。突变体LIP~(S295A)和野生型LIP蛋白的活性相似度很高,说明Ser295位点的O-糖基化残基的去除不影响LIP蛋白功能;突变体LIP~(N286A)保留与LIP蛋白可特异性结合细胞膜的这一功能下对细胞没有明显的杀伤作用,说明Asn286位点的N-糖基化残基的去除能够在不影响和细胞膜结合的情况下极大的减弱LIP的杀伤作用。值得注意的是,LIP~(N286A)突变体蛋白对MCF-7细胞不仅没有明显的杀伤作用,而且可以与细胞膜表面特异性结合,超高荧光显微镜结果表明LIP~(N286A)突变体蛋白与商品化的膜标记染料Cholera Toxin Subunit B Cenjugates Alexa 555在细胞膜表面不完全重合,证明了可以将LIP~(N286A)突变体蛋白开发成为一种新型的细胞膜染料。
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q51
【图文】：

种细胞,现象,红色染料,细胞定位

图 1.1 重组 LIP 作用不同种细胞的现象[10]Fig. 1.1 The phenomena of different cells with LIP（2）共聚焦显微镜检测 LIP 在细胞定位情况将 LIP 蛋白孵育后的 MCF-7 与 HeLa 细胞进行免疫荧光实验，可清晰的观察到 LIP 均定位于两种癌细胞的细胞膜上，标记 LIP 蛋白的绿色荧光与标记膜的红色染料不完全重合。

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