α-淀粉酶共表达系统的研究及在枯草芽孢杆菌中最优信号肽的筛选

发布时间：2020-06-29 11:01

【摘要】：现如今,α-淀粉酶大量用于食品、饲料产业中,本研究试图通过优化枯草芽孢杆菌表达系统中的信号肽,从而提高淀粉酶产量,解决淀粉酶异源表达中出现的“瓶颈”。另外,随着人们对酶制剂应用的多元化,希望一个蛋白具有多种酶学特性,使生产成本得到降低,因此开发多功能组合酶制剂将成为一定的趋势。在研究淀粉酶的基础上,通过对木聚糖酶和α-淀粉酶融合蛋白共表达的研究,帮助我们更深刻地了解到共表达系统的作用机制,为今后关于不同酶制剂之间融合蛋白的共表达提供一些有价值的参考。1、本研究以曲霉属(Aspergillus lacticoffeatus)的α-淀粉酶AmyCBS 101883和瘤胃真菌类(Neocallimastix patriciarum)木聚糖酶XynCDBFV作为主要研究对象,利用Linker Database数据库筛选三条适用于糖苷水解酶类的连接肽,通过基因重叠延伸技术(Splicing by Ovedap Extension,SOE)的手段构建出木聚糖酶与α-淀粉酶的共表达融合蛋白。并将其分别导入大肠杆菌与毕赤酵母中诱导表达。以单一酶Amy-E2和Amy-pGAP为参照,研究其酶学特性。结论如下:在pH适应性与稳定性方面:Amy-E2与融合蛋白Xyn-Amy-E2中α-淀粉酶最适pH均为7.5,当pH低于7.0时Amy-E2酶活迅速下降,而Xyn-Amy-E2在pH 4.5-7.5之间其相对剩余酶活仍保持在70%以上,在酸性条件下有较好的适应性。Linker 1连接的融合蛋白,不仅在pH 6.5及pH 7.5的环境下相对剩余酶活仍保持在95%左右,pH 8.5碱性条件下的适应性也最优,且使融合蛋白中的α-淀粉酶活性提高了23%。此外,在真核表达系统中,α-淀粉酶的pH适应性均属中偏碱性,且融合蛋白α-淀粉酶在酸性条件下优于参照酶。在温度适应性与稳定性方面:Xyn-Amy-E2热稳定性最优,耐受处理50 min后接近半衰期。融合蛋白Xyn-L2-Amy-pGAP和Xyn-L3-Amy-pGAP在55-70℃范围内有很好的适应性,相对剩余酶活在65%以上,优于参照酶Amy-pGAP。通过以上融合表达发现:在同一表达系统中,融合后表达的α-淀粉酶活性均低于单一α-淀粉酶。Xyn-Amy、Xyn-L1-Amy、Xyn-L2-Amy、Xyn-L3-Amy分别下降了36.9%、21.6%、59.0%、39.0%。当引入连接肽Linker 1时,使融合α-淀粉酶活性提高了23%。大肠杆菌中α-淀粉酶的平均酶活为0.571 U/mL,真核系统中α-淀粉酶的活性为4.208 U/mL。2、本研究以枯草芽胞杆菌表达系统pBE-S为骨架,构建来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(DL-3-4-1)的混合信号肽筛选文库。通过电转化的方法转入到枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株RIK1285中。基于96孔板微量培养,对1920株菌株的发酵液上清进行检测,对酶活位于前100的菌株进行测序。经筛选获得14条优化表达的信号肽:yomL、PhrA、PhrF、YvbX、YoqH、mpr、YuaB、YqxI、YjcM、ywoF、PhrK、peI、YceG、YddT、yobb。其中,引导α-淀粉酶最高效分泌的信号肽yomL,酶活为113.251 U/mL。进一步对其酶学性质进行分析如下:最适pH为6.5,且在中偏碱性条件下的稳定性较好,最适温度为65℃。在65℃、70℃、80℃条件下耐受1 h,其半衰期依次为80 min、70 min、40 min,表明其热稳定性较强。其中Triton x-100、Mn~(2+)、EDTA、Ni~(2+)、Co~(2+)对DL-3-4-1有激活作用;SDS、Al ~(3+)、Cu~(2+)对该酶有一定抑制作用;Ag~+、β-mercaptoethanol对该酶完全抑制。此外,该酶对来自植物种子、根茎类的粗淀粉均有很好的水解作用,有较为广泛的运用价值。
【学位授予单位】：云南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q78;Q55
【图文】：

分子结构图,分子结构,淀粉,支链淀粉

第 1 章绪论淀粉。（2）Englyst 等[5]依据淀粉的生物可利用性，将淀粉分成 3 类：快速消化型淀粉（ReadyDi-gestible Starch,RDS）、缓慢消化型淀粉（SlowlyDigestibleStarch,SDS）和抗性淀粉（Resistant Starch, RS）。（3）根据淀粉的结构可分为直链淀粉和支链淀粉。不同植物来源的淀粉中直链淀粉和支链淀粉所含的比例差异较大，一般直链淀粉约占 10%-30%，支链淀粉约占 70%-90%[6]。在植物生长代谢过程中，不同植物的直链淀粉和支链淀粉与一些脂类结合，以复杂的组织形式，围绕中心由内向外，形成大小、形状和结构都不同的淀粉粒，储存于根茎、种子和果实的细胞组织里[7]。1.1.2 淀粉的分子及结构特点

β-折叠,α-螺旋,圆桶,三维结构

由一个 β-折叠与 DomainA 相连。如图（1.2）为来自真菌米曲酶 Taka-amylase（TAA），是第一个被确定三维空间结构的 α-淀粉酶，它具有典型的（β/α）8 TIM 桶状结构[26]，因此成为 α-淀粉酶研究的模式分子。图（1.1）中（a）是 TAA 的三维结构；（b）是对（β/α）8 -barre fold α-螺旋与 β-折叠相对位置的解析。在 α-淀粉酶的结构基础上再分析其酶作用的机制，如下：淀粉酶的催化活性中心由（β/α）8 TIM 桶状结构构成，即由 N-端肽链形成交替排列的各八个 β-折叠和 α-螺旋，在空间上八个 β-折叠排列在内，八个 α-螺旋围绕在外，形成一个中空的（β/α）8 桶状结构（TIM-barre），此结构为 α-淀粉酶分子的结构域 A（DomainA）；在 β3 与 α3 之间有一段长约 70 个氨基酸残基，形成了结构域 B（Domain B）呈 β-折叠，其中包含 Ca2+离子结合位点[27]；C-端为 DomainC。β4 的天冬氨酸（Aspartate）、β5 的谷氨酸（Glutamate）、β7的天冬氨酸（Aspartate）分别作为反应中的亲核剂、质子供体及辅助，构成酶与底物作用的基础。在裂解 α-1,4 糖苷键的同时，保留产物末端的 α-构型[28,29]。

【参考文献】