THAP11对造血干细胞功能与发育的调控作用研究

发布时间：2020-07-04 17:19

【摘要】：THAP11是THAP蛋白(Thanatos-associated protein)家族中的最新成员,人THAP11在小鼠中的同源基因称作Ronin。Ronin最早发现于小鼠胚胎发育早期阶段,其对于体内和体外维持胚胎干细胞多能性都是必须的。现有研究显示,THAP11主要通过转录因子相互作用网络调控细胞的增殖、分化、凋亡及线粒体功能,主要体现在抑制肿瘤细胞的生长、调节胚胎干细胞的干性和调控多能干细胞的增殖与分化的过程中。但THAP11对造血干细胞的调控作用仍未见报道。我们实验室前期研究发现,在红白血病细胞系(K562)中,THAP11调控红系/巨核系分化平衡,这提示我们THAP11可能在造血调控过程中发挥着重要作用。本研究利用人原代脐带血CD34~+细胞以及条件性敲除小鼠模型,系统分析了THAP11对HSC功能以及造血系统发育的影响。基于RNAi慢病毒系统,敲低人脐带血(Cord blood,CB)CD34~+细胞中THAP11基因表达,检测THAP11对HSC体内重建、体外生长、增殖、周期以及凋亡的影响。结果显示,将敲低THAP11的CB CD34~+细胞移植入经致死剂量照射的免疫缺陷小鼠中,移植后三个月,THAP11干涉组人源GFP~+细胞重建率明显低于对照组。体外集落培养实验结果显示,敲低THAP11后,CB CD34~+细胞成集落能力显著降低,且与干涉效率相关。而体外扩增培养体系中,THAP11干涉后,CB CD34~+细胞在体外培养的过程中增殖速率降低,CB CD34~+细胞周期进展阻滞在G0/G1期,撤除所有细胞因子,THAP11干涉组细胞凋亡增多。在巨核系诱导培养体系中,敲低THAP11后CB CD34~+细胞向巨核系分化减少;在红系诱导培养体系中,敲低THAP11后CD34~+细胞向红系分化也减少。以上研究结果表明,THAP11对人造血干细胞功能有重要的调控作用,但调控作用机制还需进一步研究。本研究在实验室前期研究基础上,基于LoxP-Cre系统构建了Ronin基因造血系统条件性敲除(Conditional Knockout,CKO)小鼠,统计Ronin~(flox/flo x)(flanked by loxP)基因型小鼠与Ronin~(flo x/+)Vav-iCre~+基因型小鼠交配后产生子代基因型比例,结果显示Ronin~(flox/flo x)Vav-iCre~+基因型的小鼠实际出生率不符合孟德尔定律,仅有1只小鼠出生且在一周内死亡,表明造血系统特异敲除Ronin导致胚胎无法存活。进一步解剖13.5dpc(days post coitum)、14.5dpc、15.5dpc和18.5dpc孕鼠胚胎,观察Ronin CKO小鼠形态学表型,结果显示Ronin CKO小鼠胚胎通体苍白,卵黄囊、胎盘、胎肝三个主要造血器官明显发白,且随着时间的推移,形态学表型加重,胎肝变小且细胞数量减少,循环血中红细胞脱核比降低,胚胎表现出严重贫血表型。进一步分析13.5dpc、14.5dpc和15.5dpc孕鼠胚胎胎肝中细胞组成,利用CD71和TER119标记不同发育阶段红细胞,结果显示,红系发育在CD71~(hi)Ter119~+细胞阶段受到阻滞,阻滞发生在细胞由大到小的进展过程中,且整个胎肝中Ter119~+细胞严重减少。利用Lin~-c-Kit~+Sca1~-标记造血祖细胞(Hematopoietic progenitor cell,HPC)、Lin~-c-Kit~+Sca1~+标记造血干细胞(Haematopoietic stem cell,HSC),分析胎肝中造血干、祖细胞组成。结果显示,13.5天时Ronin CKO小鼠胎肝中Lin~-c~-Kit~+Sca1~+细胞数量显著增多,随着胚胎的发育至15.5天时细胞数量无明显差异;13.5天时,Lin~-c~-Kit~+Sca1~-细胞数量无明显差异,至15.5天时,Lin~-c~-Kit~+Sca1~-细胞数量显著减少。体外集落形成实验的结果显示,Ronin缺失后13.5dpc胎肝细胞集落成能力显著低降。此外,13.5dpc、14.5dpc和15.5dpc Ronin CKO小鼠胎肝中细胞凋亡均显著增加。Ronin CKO小鼠模型的建立证实Ronin是造血系统发育过程中必须的调节因子,条件性敲除导致小鼠胚胎严重缺血,无法正常存活。胚胎表型的初步检测结果提示,Ronin在造血早期发育过程中的调控作用于两个节点:一方面,在胚胎红系发育过程中,Ronin条件性缺失阻滞红系终末分化,难以产生成熟红细胞,导致胚胎严重贫血;另一方面,Ronin条件性缺失影响了造血干、祖细胞功能,最终导致胚胎整个造血系统发育障碍。综上所述,本研究在敲低THAP11表达的人CB CD34~+原代细胞模型和Ronin CKO小鼠模型中研究了THAP11对造血干细胞功能以及造血系统发育的调控作用,证实THAP11是调控造血干细胞功能及造血系统发育过程中必需的调控因子,并为后续机制研究提供了可靠线索和动物模型。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q344
【图文】：

小鼠,策略,军事科学院

α购自北京博迈德生物技术有限公司；慢病毒包装质粒 pMD2G、pSPAX2，表达质粒 pSicoR、siTHAP11-pScicoR 为本实验室保存。2.1.4. 实验动物B-NSGTM(B-NDG ) （NOD-Prkdcscidll2rgtm1/Bcgen）小鼠购买自北京百奥赛图基因生物技术有限公司，于军事科学院军事医学研究院 20 号院动物饲养中心，SPF 级条件下饲养，环境温度保持在 20-26℃，日温差不差过 4℃，湿度为 40%-70%，光照周期 12 小时：12 小时，光照强度 15-20lux（鼠笼中照度），噪声不超过 60 分贝。Roninflo x/-小鼠由华夏凯奇公司制备构建策略如图 1A 所示，Vav-iCre+小鼠由军事科学院军事医学研究院从玉文教授赠送(Jackson Laboratory；#008610；B6.Cg-Commd10Tg(Vav1-icre)A2Kio/J)，两种小鼠均为 C57BL/6J 背景，饲养于军事科学院军事医学研究院27 号院实验动物中心 SPF 级实验动物房饲养、繁殖（繁殖策略见 2.2.3）。

小鼠,离心管,涡旋,饱和氯化钠溶液

图2 Roninflox/floxVav-iCre+小鼠繁殖策略Fig 2 Roninflox/floxVav-iCre+mouse breeding strategy2.2.5. 小鼠基因型鉴定1)小鼠基因型鉴定DNA模板制备取3周龄小鼠尾尖5mm置于1.5mL 离心管中，每管加入300μL组织消化液（50mM Tris-HCl (pH=7.5)，100mM NaCl，10mM EDTA，0.5%SDS）和12μL蛋白酶K（10mg/mL，Merck公司），颠倒混匀，置于60℃震荡裂解过夜。之后加入150μL饱和氯化钠溶液，涡旋震荡，冰浴10min，12000rpm离心7min。小心吸取上清350μL到新离心管，加入650μL无水乙醇，涡旋混匀，可以看到有白色絮状沉淀，13000rpm离心5min。弃掉上清，加入75%乙醇750μL，上下颠倒5～10次，13000rpm离心5min，弃上清，静置使乙醇挥发干净。加入100μL去离子水，将DNA溶解2小时以上，4℃保存备用。

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