组蛋白H3K14乙酰化调控紫色紫孢菌生长和产孢的机制研究

发布时间：2020-08-10 19:09

【摘要】：紫色紫孢菌(Purpreocillium lavendulum)是目前已实现商品化的线虫生防真菌。本研究以紫色紫孢菌Ku80敲除菌株为出发菌株,首先利用同源重组的方法对组蛋白H3K14位点进行点突变,同时敲除修饰组蛋白H3K14乙酰化的组蛋白乙酰基转移酶gcn5,之后对Ku8K敲除菌株和各突变株的生长和产孢进行测定和比较,并结合转录组学和基因功能分析等方法研究组蛋白H3K14乙酰化调控紫色紫孢菌的生长和产孢的机制。通过以上研究可以初步阐明组蛋白修饰调控紫色紫孢菌产孢的分子机制。主要研究结果如下:1.获得H3K14突变菌株首先获得H3K14位点突变成R和Q的H3片段,然后酶切质粒H3-3'-pPK2-sur-GFP,经过In-fusion酶连接将突变片段连接到sur基因的另一端。将构建好的突变载体通过农杆菌介导的方法转化紫色紫孢菌Ku80菌株,用氯啼磺隆筛选转化子,通过测序和Western blot的方法对转化子进行验证。2.获得gcn5敲除菌株首先酶切质粒pPK2-sur-GFP,然后经过In-fusion酶连接将gcn5上下游同源片段连接到sur基因的两端。将构建好的敲除载体通过农杆菌介导的方法转化紫色紫孢菌Ku80菌株,用氯嘧磺隆筛选转化子,通过PCR等方法对转化子进行验证。3.突变株和敲除株的生长和产孢受到影响Ku80菌株的孢子形成能力相对高于突变株和敲除株。在所研究培养基上,除PDA培养基外,H3K14Q突变株和gcn5敲除株与Ku80菌株相比生长速度均降低。然而,在PDA培养基上,H3K14R突变株的生长速度相对高于Ku80菌株,并且在其它培养基上没有显著变化。4.各突变株和敲除株的转录组分析组蛋白的翻译后修饰会影响染色质的结构,从而会影响基因的表达[2]。不管是H3K14R突变株还是H3K14Q突变株,或者是gcn5敲除株,与Ku80菌株相比,组蛋白H3K14的乙酰化水平均处于异常状态。这种非正常的乙酰化或者去乙酰化状态将会影响紫色紫孢菌的一些生长和产孢相关基因,从而导致H3K14Q突变株和gcn5敲除株的生长和孢子形成能力的降低,以及H3K14R突变株产孢能力的降低。为了在不同菌株中发现这些受影响的生长和孢子形成相关基因,分析了上述的表型,确定样品收集的时间点,将Ku80菌株和各转化子的样品进行转录组分析比较。对表型有明显差异的菌株之间的差异基因进行分析,找出依赖表观遗传修饰的代谢相关基因。本论文的主要创新点:真菌在营养匮乏的环境中停止生长并产孢是其重要的生存策略,从表观遗传调控的角度探讨饥饿诱导真菌生活史转化的分子机理并未见报道,本研究从组蛋白H3K14突变体出发,通过筛选PDA中营养胁迫的营养物质,结合转录组分析和突变体库筛选等方法试图阐明组蛋白H3K14介导的营养胁迫诱导产孢的分子机制,为全面理解真菌适应环境胁迫调控生活史转变的生存策略奠定理论基础。
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：Q939
【图文】：

表观,位点,遗传修饰,资料来源

组蛋白H3K14位点所受修饰Figurel一1ModificationofHist朋eH3K14Site资料来源:表观遗传修饰，ab.~官网

差异表达基因,植物寄生线虫,大农业,研究思路

Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ邋Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ邋Ｇｅｎｅｓ邋Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ＧＣＮ５，２９＊逡逑文研究思路及内容逡逑球农业病害中，植物寄生线虫己经上升为第二大农业病害。据统计，全逡逑，由于植物寄生线虫的破坏造成的年度经济损失超过１５７０亿美元［３４】，逡逑言，至２０００年全国每年累计发生各种病虫害的面积高达３亿公顷，其中逡逑

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第三章实验结果与分析逡逑第三章实验结果与分析逡逑．组蛋白Ｈ３Ｋ１４的突变影响紫色紫孢菌的生长和产孢逡逑１含有Ｑ／Ｒ突变位点的Ｈ３片段的获得：逡逑用使用ＮＥＢｃｈａｎｇｅｒ设计的Ｈ３Ｋ１４的Ｑ和Ｒ突变引物以及Ｑ５点突变试剂盒逡逑５邋Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ邋Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ邋Ｋｉｔ）ＰＣＲ邋扩增质粒邋ｐＥＡＳＹ－Ｂｌｕｎｔ邋Ｚｅｒｏ邋Ｃｌｏｎｉｎｇ邋Ｋｉｔ，逡逑ＬＤ反应后转化大肠感受态，挑取单菌落进行测序得到突变的菌株。测序结果如逡逑３－１－１、２所示：逡逑

【参考文献】