银杏GBM5及GBM6基因的克隆和表达分析

发布时间：2020-09-12 14:16

　　银杏(Ginkgo biloba L.)属于单科单属裸子植物,是原产于我国的一种现存最古老的孑遗物种。银杏较长的童期严重阻碍了银杏育种的进程,限制了银杏的经济效益和社会价值。已有研究表明,MADS-box基因家族成员能够缩短植物童期,促进开花。本研究结合银杏转录组测序数据,筛选到15个银杏MADS-box家族基因,并对其中的Gb16301(命名为GBM5)和Gb01884(命名为GBM6)进行序列分析和表达分析。主要研究结果如下:1、银杏MADS-box家族基因成员的鉴定对银杏花芽分化时期的转录组测序数据进行筛选,得到15个银杏MADS-box家族基因,15个基因编码的蛋白长度在150-450 aa之间;蛋白分子量在19373.4-50 951.76 Da之间;在染色体中的分布不均匀。聚类分析显示,银杏15个MADS-box家族基因中属于I型Mγ亚族的有2个,属于MIKC型基因有13个,进一步分类到TM3、TM8、AG、GGM13、SVP亚族。2、银杏GBM5和GBM6基因的克隆采用RT-PCR技术,以银杏茎端的cDNA为模板,根据转录组数据中的序列信息设计特异性引物,克隆得到了GBM5(Gb16301)和GBM6(Gb01884)的全长CDS序列。GBM5包含一段732 bp的开放阅读框,预测其编码的蛋白质的分子式为C1188H1923N357O366S12。GBM6基因包含一段756 bp的开放阅读框,预测其分子式为C2251H3748N756O917S163。3、银杏GBM5和GBM6的表达分析及表达载体的构建结合聚类分析结果和表达分析数据发现,银杏GBM5基因与苏铁等其他物种的AG基因同源性较高,表达模式与其他植物AG基因的表达模式相似,即在茎端和叶片中的表达量随着花芽分化过程呈显著下降的趋势。银杏GBM6基因在银杏叶片中的表达量较高,在银杏茎端和叶片中的表达量随着花芽分化过程呈显著下降的趋势,且在叶片中下降的幅度较大。本实验成功构建了pEGAD-GBM5和pEGAD-GBM6过表达载体,以便进一步研究GBM5和GBM6基因的功能。
【学位单位】：中南林业科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

银杏,基因家族,基序,蛋白

选取拟南芥、水稻、买麻藤、挪威云杉、油松、日本柳杉的ＭＡＤＳ－ｂｏｘ蛋逡逑白共计８３条蛋白序列，与转录组测序筛选到的１５个银杏ＭＡＤＳ－ｂｏｘ蛋白利用逡逑ＭＥＧＡ７．０构建Ｉ型和ＭＩＫＣ型ＭＡＤＳ－ｂｏｘ蛋白系统发育树。结果如图２＿２和２．３逡逑所示，黑色实心标注的为银杏的２条Ｉ型和１３条ＭＩＫＣ型ＭＡＤＳ－ｂｏｘ蛋白。逡逑系统发育学中一般将Ｉ型ＭＡＤＳ－ｂｏｘ蛋白分为Ｍｃｕ邋Ｍｐ和Ｍｙ。随机选取拟逡逑南芥ｏｕ邋（３、ｙ三种类型的１１条蛋白序列与Ｇｂ３３１６８和Ｇｂ３８８８３构建的系统发逡逑育进化树，结果（图２．２）显示：Ｇｂ３３１６８和Ｇｂ３８８８３与拟南芥Ｙ型蛋白聚为一逡逑支

茎端,银杏,样品,条带

样品总ＲＮＡ图谱中２８Ｓ邋ｒＲＮＡ条带、１８Ｓ邋ｒＲＮＡ条带及５Ｓ邋ｒＲＮＡ条带均较为明逡逑显，说明提取的总ＲＮＡ较完整，条带清晰，所提取的ＲＮＡＯＤ２６0ｎｍ／ＯＤ２８Ｇｎｎ＾逡逑介于１．９－２．０之间，纯度较高，满足后续实验的需要（图３．１）。逡逑１逡逑■逡逑图３．１银杏茎端样品总ＲＮＡ逡逑Ｆｉｇ邋３．１邋Ｓｔｅｍ邋ａｐｅｘ邋ＲＮＡ邋ｏｆ邋０／＞７故６＞逦Ｌ逡逑２７逡逑

序列,菌液,银杏

３．３．２．１邋Ｇ５Ｍ５基因的克隆逡逑以银杏茎端的ｃＤＮＡ为模板，以特异性引物及为引逡逑物，通过ＰＣＲ扩增得到了长度为７３２邋ｂｐ的ＤＮＡ片段（图３．２），筛选单个阳性克逡逑隆菌株（图３．３）测序，在ＮＣＢＩ上对测序结果进行序列比对，与银杏逡逑家族中的ＡＧＡＭＯＵＳ－ｌｉｋｅ基因Ｇ５Ｍ５（登录号：ＡＹ１１４３０４．１）的比对率较高，因此逡逑对克隆到的序列命名为ＧＳＭ５。逡逑图３．２ＧＢＭ５基因克隆逡逑Ｆｉｇ邋３．２邋ＰＣＲ邋ｐｒｏｄｕｃｔ邋ｏｆ邋ＧＢＭ５逡逑Ｍ：ＭＤ１１６邋ＤＮＡＭａｒｋｅｒ邋；邋１：目的基因逡逑Ｍ逦１２逦３逦４逡逑ｍｍ逡逑ｍｓｍ逡逑图３．３邋ＧＢＭ５菌液ＰＣＲ检测逡逑Ｆｉｇ邋３．３邋Ｂａｃｔｅｒｉａ邋ｌｉｑｕｉｄ邋ＰＣＲ邋ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＧＢＭ５逡逑Ｍ：ＭＤ１１６邋ＤＮＡ邋Ｍａｒｋｅｒ邋；邋１－４：目的基因逡逑２８逡逑

【参考文献】