半理性设计改造环氧水解酶PvEH1的立体选择性

发布时间：2020-09-16 12:07

　　环氧水解酶(epoxide hydrolases,EHs,EC 3.3.2.-)可对映选择性催化外消旋环氧化物开环,形成相应的光学纯邻二醇和保留未反应的环氧化物,或区域选择性开环,将底物完全转化为手性邻二醇。手性邻二醇是一类药物的手性砌块,例如R型间氯苯基乙二醇(wCPED)可用于合成一种β3-肾上腺素受体激动剂。本实验室前期从菜豆(Phaseolus vulgaris)基因组扩增了一种新型EH的编码基因(pvehl),并在E.coli BL21(DE3)中表达。研究表明,PvEH1对间氯环氧苯乙烷(mCSO)催化特性不理想。本研究以PvEH1为对象,拟借助分子对接、定点突变等技术分析其底物结合口袋对催化特性的影响。通过定向改造PvEH1改善其催化特性并进行机制分析。最后,优化反应条件并规模制备(R)-mCPED。对PvEH1进行同源模拟,构建了其3D结构模型。分别以(R)-与(S)-mCSO为模式底物,通过分子对接,确认了 23个底物结合口袋上与mCSO发生相互作用的位点(除催化位点)。再结合PvEH1与多个高对映归一性EHs序列比对的结果和文献报道确认了16个位点的拟取代氨基酸,剩余7个位点分别以亮氨酸取代。分别构建了 23个单点突变体,其中酶活性显著提高的单点突变体包括PvEH1V1061、PvEH1M129L、PvEH1M160A、PvEH1M175I和PvEH1S178T等5个,其中最优为PvEH1M129L,酶活性是PvEH1的1.6倍;对映归一性显著提高的单点突变体包括PvEH1W102L、PvEH1L105I、PvEH1Y149L和PvEH1P84L等4个,对映归一性最高为PvEH1W102L(80.6%eep),是PvEH1 的 80.6倍。将9个提高PvEH1催化特性的位点分为两类:5个位点提高酶活性(106、129、160、175和178)和4个位点提高对映归一性(102、105、149和184),分别进行单点饱和突变以筛选各位点上的最优氨基酸。结果表明,5个提高酶活性的位点最优氨基酸分别为I、L、A、I和T,并构建5位点随机组合突变文库并筛选获得了酶活性最优突变体PvEH1Z4(包含V106I、M160A、M175I和S178T)酶活性为野生型的3.1倍。4个提高对映归一性的位点最优氨基酸分别为L、I、L和W。以PvEH1Z4为模板,构建4位点随机组合突变文库并筛选获得了最优突变体PvEH1Z4X4-59(包含V106I、M160A、M175I、S178T、L105I和P184W),与PvEH1相比,酶活性和对映归一性分别提高了 2.6倍和92.6 倍。测定了 PvEH1和其突变体区域选择性系数和对映体比率(enantiomeric ratio,E),并结合分子动力学模拟技术分析其提高机理。意外发现,W102L可大幅提高突变体的对映选择性,例如E.coli/pveh1W102L对mCSO的E值为30,不利于其对映归一性水解rac-mCSO。另外,E.coli/pvehlW102L对与mCSO相似的底物对氯环氧苯乙烷(pCSO)E值为89。这意味着E.coli/pvehlW102L可应用于动力学拆分rac-pCSO。这可能是由于102位被亮氨酸取代抑制了PvEH1W102L活性中心与(R)-pCSO结合,却未影响其结合(S)-pCSO,优先催化(S)-pCSO水解,进而提高了 PvEH1W102L对pCSO的对映选择性。另一方面,184位被色氨酸取代、105位被缬氨酸取代后的PvEH1Z4X4-59区域选择性系数αS和βr均大于96%。根据分子动力学模拟结果,PvEH1Z4X-59上W184的侧链基团与(S)-mCSO上氯基发生相互作用,使后者的Cα优先受到攻击而生成(R)-mCPED,同时与(R)-mCSO结合方式保持不变,赋予了PvEH1Z4X4-59对rac-mCSO的对映归一性。优化了 E coli/pvehlW102L动力学拆分rac-pCSO初始反应浓度和反应时间。E.coli/pvehlW102L催化150 mM rac-pCSO 4 h后,可同时获得高纯度的(R)-pCSO和(R)-pCPED,(R)-pCSO的产率为45.62%,ees为96.3%;(R)-pCPED 的产率为50.91%,eep为90.26%。另外,优化了E.coli/pvehlZ4X4-59对映归一性水解rac-mCSO 反应介质和rac-mCSO的浓度。在含5%吐温20的磷酸缓冲液中,水解2.7 g rac-mCSO制备了2.51g(R)-mCPED,eep为93.1%,时空产率为6.32g·h-1.L-1。
【学位单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q814
【部分图文】：

示意图,示意图,苯基取代,区域选择性

江南大学硕士学位论文即在催化单一构型的 SO 时，StEH1 存在区域选择性，子时，会优先攻击某一个碳原子：如果进攻有苯基取代的将会翻转；如果进攻没有苯基取代的碳原子 (Cβ)，则其外文献报道发现，这种现象在由 EHs 催化的反应中具EHs 对不同构型底物所呈现的区域选择性互补可以将外邻二醇产物，即利用 EHs 对不同构型底物高度互补的化物。

流程图,定向进化,流程图,突变酶

图 1-2 定向进化流程图Fig. 1-2 General strategy for directed evolution点的选择性位点周围或者底物结合口袋附近选择对酶与底物结合有较理想的策略[47]。例如，Kotik等人，选择来自于AspergillunEH底物口袋周围的五定点饱和突变构建了包含有9个位点到了一株对映归一性提高19倍的突变酶[48]；Li等人，在VrEEH) 底物口袋周围选取了4个氨基酸位点进行突变，构建了一株对映归一性几乎完美的突变酶[17]；Sun等人，选取erythropolis基因的EH) 底物口袋周围10个氨基酸位点，采用 (Triple-CodeSaturationMutagenesis，TCSM) 构建了突变文的突变酶[49]。另外，借助于计算机辅助设计选取突变位点也包括虚拟突变文库筛选、突变扫描、多序列比对等手段的引位点的效率。

双相,中环,体系,吐温

图 1-3 EHs 催化双相体系中环氧化物的水解Fig. 1-3 EHs catalyzed the hydrolysis of epoxide in a biphasic system型表面活性剂溶剂相同，非离子型表面活性剂如曲拉通 100、吐温 20 和吐温酶活性和对映归一性。在加入 2% (v/v) 吐温 20 的反应体 crescentus 和 Mugil cephalus 的两种 EH 分别对 SO 进行对映归-1,2-乙二醇 (phenyl-1,2-ethanediol，PED)，对映体纯度为 89％Hs 催化外消旋环氧化物的对映归一性的机制仍不明确，似乎，在脂肪酶的相关研究中，催化机理已经有了比较深入的研究[6型表面活性剂 (不带电且具有亲水性头) 是温和的，与蛋白质于增强脂肪酶活性，不像离子型表面活性剂，如十二烷基磺酸表面并降低脂肪酶活性[63]。的研究意义和研究思路

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