四环素对金鱼肠道菌群耐受性和菌群结构影响的研究

发布时间：2020-09-17 19:44

　　近几十年来,抗生素(Antibiotics)污染成为了一个亟待解决问题。水环境中,长期的抗生素压力可能破坏鱼类肠道菌群的结构平衡。水生动物的肠道在抗生素耐药基因(Antibiotic resistant genes,ARGs)的传播中占据着重要的生态位,并能直接反映其生境变化。四环素(Tetracycline)是自然环境中检测频率第二高的抗生素。然而,目前关于环境浓度四环素对鱼类肠道细菌耐受性以及肠道菌群结构影响的综合性研究仍然匮乏。为了探究实际环境浓度四环素对鱼类肠道菌群耐药性和肠道菌群结构的影响,本研究以金鱼为试验对象,使用不同浓度四环素(0.285,2.85μg/L)处理金鱼至21天,分别在第7天和第21天取样,首先采用平板涂布法统计肠道可培养细菌耐药率,用特异性引物gyrB检测,结合生理生化试验和16S rRNA基因序列筛选鉴定气单胞菌属(Aeromonas)耐药菌,并使用微量肉汤稀释法检测分离株的最小抑菌浓度(MIC)值;其次使用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术检测肠道内容物中的四环素耐药基因(tetA、tetB、tetC、tetG、tetK、tetL、tetM、tetO、tetQ、tetW、tetZ和tetX),磺胺耐药基因(sul1、sul2和sul3)和整合子(intI1和intI2)的丰度;最后通过高通量测序表征肠道菌群结构的变化情况。主要研究结果如下:1.四环素处理金鱼7天后,低浓度组(L7)的耐药率未发生显著变化(1.04%),但7天高浓度组(H7)以及处理21天后低浓度组(L21)和高浓度组(H21)组的抗性细菌比例均显著增加,分别增至23.0%;38.43%,62.05%。这表明经四环素处理金鱼后可显著提高肠道可培养细菌的耐药比率。2.在本研究中,分别在C7,L7,H7,C21,L21和H21组中分离出21,15,47,26,36和19株气单胞菌属耐药菌株。共鉴定出6种Aeromonas细菌,包括A.salmonida,A.hydrophila,A.caviae,A.media,V.schubertii和V.sobria。四环素处理金鱼后,处理组中的A.schubertii和A.salmonicida逐渐成长为优势种;并随着四环素浓度的增加和处理时间的延长,优势种从A.salmonicida变为A.Schubertii。3.对照组共分离的47株菌株中有38株的MIC值为32μg·mL~(-1),剩余9株耐药菌的MIC为64μg·mL~(-1)。然而,L7和H7组的耐药菌株MIC值增至128μg·mL~(-1),且H21组中1/4的耐药菌株MIC值高达256μg·mL~(-1),表明持续的四环素压力可以显著提高细菌的耐受性。4.所有的耐药基因(除了tetB),在金鱼肠道中均有检出。四环素处理21天后大部分基因的相对丰度显著增加,其中,tetA、tetC、tetG和tetZ等的相对丰度最高(高于1.0×10~(-2)水平),表明四环素压力是耐药基因增加的主要因素。此外,四环素外排类耐药基因的平均相对丰度(1.0×10~(-2))显著高于编码核糖体保护蛋白(平均水平1.0×10~(-3))和编码四环素灭活酶(平均水平为1.0×10~(-5))的其他基因,表明四环素外排泵机制是微生物应对环境四环素胁迫的主要机制。5.Fusobacteria,Firmicutes和Proteobacteria是金鱼肠道细菌的3个优势门类,在四环素处理下其多样性分别呈现增加,减少和动态平衡的趋势,属水平也呈现类似趋势,表明四环素压力对金鱼肠道微生物区系的组成有显著影响。多级物种差异判别分析(LEfSe)结果表明,在处理组中Fusobacterium,Kaistia,cetobacterium,Meganema,Aminobacter和Bosea是金鱼肠道的标志菌属。此外,ARGs与肠道Cetobacterium,Rosemonas,Rhizobiales和Bosea等属之间具有较强的相关性,表明以上属可能是ARGs的潜在宿主。本研究探究了环境浓度四环素对金鱼肠道菌群耐药性和肠道菌群结构的影响,该结果有助于深入了解三者之间的作用情况,且对控制抗生素耐药性的战略制定和人类健康风险的评估具有一定现实意义。
【学位单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q17;X503.225
【部分图文】：

四环素类,化学结构式,四环素

类（1948 年~1963 年）属于天然四环素，主要包括：结构式见图 1-1。金霉素和土霉素都是在 20 世纪 4的第一个成员。这些分子分别是金黄色链霉菌霉菌（S. rimosus）的产物（Duggar 1948, 2011; Fin产生的其他天然四环素，例如由金黄色葡萄球菌（环素。第二代半合成四环素（1965 年~1972 年），新型化合物，半合成四环素的开发侧重于改善四环主要包括：强力霉素、米诺环素、多西环素以及甲药代动力学（Agwuh andAlasdair, 2006）。第三代四基甲基环素。甘氨酰环素是 9-甘氨酰胺类似物，例素等，这种结构修饰确保了与核糖体的更有效的相性机制，包括第一代和第二代四环素的外排转运蛋, 2004）。

四环素,气单胞菌属

定的气单胞菌属分离株的比例。C7 和 C21 分别代表 7 天和 21 天表 0.285 μg·L-1四环素处理 7 天组，2.85 μg·L-1四环素处理 7 天四环素处理 21 天组，2.85 μg·L-1四环素处理 21 天组。ions of identified Aeromonas isolations in different groups. C7 and Control groups, respectively, and L7, H7, L21, H21 represent samples samples in 2.85 μg·L-1group at 7days, samples in 0.285 μg·L-1grousamples in 2.85 μg·L-1group at 21 days, respectively.

肠道微生物,金鱼

图 3-1 金鱼肠道微生物 16S rRNAPCR 扩增结果Fig. 3-1 16S rRNAamplification results of intestinal microflora in goldfish以看出（图 3-1），PCR 产物目的条带清晰单一，大小正确，且测，符合上机要求可以进行后续试验。道菌群多样性分析中，共收集了 15 个样本中的 691 221 个高质量序列，将每个样度（抽平后每个样本 42,038 条序列）并进行聚类后，在 3％差操作分类单位（OTU）。稀释曲线（Rarefaction curves）是指在量的序列，统计其所代表的物种数目，再以序列数与物种数来构样品数据量是否合理。本研究样品的 OUT 稀释曲线如图 3-2 所逐渐趋于平坦，且所有样品的覆盖度（coverage）都达到了99.9%（的测序深度合格，测序数据合理可用。

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