稳冷冻超分辨荧光显微成像系统构建与冷冻光电融合成像支撑膜探索研究

发布时间：2020-09-19 11:04

　　光电融合成像技术(Correlative Light and Electron Microscopy,CLEM)已成为生命科学领域一个强有力的研究工具,尤其是冷冻光电融合成像技术(Cryo-CLEM),被认为是一种接近生物样品天然状态的成像技术。冷冻样品制备方法能避免化学固定方法对样品结构的破坏,使样品处于近天然状态,保留近原子尺度的结构信息;冷冻荧光成像技术(Fluorescence Cryo-Microscopy,Cryo-FM)可对特异性标记的目标生物大分子或结构进行纳米尺度的识别和定位,但分辨率暂且还未达到解析其超微结构的层次;冷冻电镜技术(Cryo-Electron Microscopy,Cryo-EM)具有超高分辨率,可对生物大分子或结构进行近原子分辨率的结构解析,但缺乏高效精确识别、定位特定目标生物大分子或结构的能力。冷冻光电融合成像技术将冷冻样品制备、冷冻荧光成像和冷冻电镜这三种技术结合并实现优势互补,使研究者可以在细胞原位对目标生物大分子或结构同时实现高精度的定位分析和高分辨的结构解析。冷冻光电融合成像技术方兴未艾,还存在很多技术上的不足。本论文将从冷冻光镜平台和样品支撑膜两个方面入手,进一步完善冷冻光电融合成像技术。本论文第一部分主要介绍超稳冷冻超分辨荧光显微成像系统的设计和构建,并通过对冷冻含水切片和完整细胞样品的光敏定位显微成像(Photoactivated Localization Microscopy,PALM)验证系统的超分辨成像能力。与原有的冷冻荧光显微成像系统相比,该系统具有以下优势:1)超高的温度稳定性:系统温度平衡后,物镜和样品10个小时内的温度波动均小于0.06 K(半小时内的温度波动小于0.02 K);2)极高的机械稳定性:在93 K温度情况下,荧光珠样品在5个小时内的X、Y、Z三轴机械漂移均小于200 nm;3)所设计的换样装置和流程可确保在135 K温度以下高效安全装载、转移和回收冷冻含水样品;4)具备超分辨成像能力(本次工作冷冻含水切片和完整细胞样品的单分子平均定位误差分别是13.0 nm和13.6 nm)。本论文第二部分主要介绍冷冻光电融合成像支撑膜的探索研究。我们利用氧化铟锡(Indium Tin Oxide,ITO)改善方华膜(Formvar film)的导电性能,开发了新型的Formvar-ITO支撑膜,并利用新型支撑膜承载冷冻含水切片进行超分辨冷冻光电融合成像,实验结果证实该支撑膜可以满足冷冻光电融合成像的需求。此外,我们还利用构建的成像系统和发展的样品支撑膜参与了p62阳性蛋白聚集体结构的研究,通过冷冻光电融合成像,我们发现该聚集体是一种特殊的多层膜结构,结构的获得为其功能的进一步研究提供了证据。和原有的样品支撑膜相比,新型支撑膜具有以下优势:1)激光吸收远远小于10 nm碳膜,常用激光波段(405 nm、488 nm、561 nm、647 nm),10 nm ITO薄膜的光吸收约为10 nm碳膜的44.4%、16.8%、14.9%、16.1%;2)承载冷冻含水切片时可承受约2.0 kW/cm~2的488 nm激光照射,能够满足Cryo-PALM成像的需求;3)冷冻电镜下Formvar-ITO支撑膜的性能优于Formvar-Carbon支撑膜,适合冷冻电镜成像。本论文所涉及的两部分内容既相互独立又具有内部紧密联系。超稳冷冻超分辨荧光显微成像系统优异的温度和机械稳定性以及新型样品支撑膜良好的透光性和导电性,共同为实现玻璃态生物样品的Cryo-PALM成像提供了必要的技术支撑。同时,二者对现有冷冻光镜平台和样品支撑膜方面的优化改进,又都为进一步完善冷冻光电融合成像技术提供了新方案。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q6-33
【部分图文】：

胡克,显微镜,来源,图片

图 1.1 胡克的复式显微镜和现代显微镜（图片来源 olympus-lifescience.com.cn）Figure 1.1 Hooke microscope and Modern microscope与显微镜的其它部分相比，样品照明方式的发展就慢得多。最开始使用的照明方式是临界照明，其存在照明不均匀和容易损坏样品等缺点。1893 年，德国工程师柯勒发明了柯勒照明技术，这项技术克服了临界照明的缺点，为显微镜提供了均匀的照明方式。细胞样品通常是透明的，一般需要染色后才能看清内部的结构，1935年，荷兰科学家泽尼克发明相差显微镜（Phase Contrast Microscope）[1]，使得显微镜可以观察未经染色的细胞，他也因此获得了1953年的诺贝尔物理学奖。在其基础上，1952 年波兰科学家诺马斯基发明了微分干涉相差显微镜（Differential InterferenceContrast Microscope）[2]，与相差显微镜相比，其主要优点是增强了样品图像的三维立体感，样品也可略厚一些。显微镜技术的进步和生命科学的发展是相辅相成的，显微镜的发展使得人们对

荧光发射,来源,图片,原理图

成像技术不同，它是利用荧光基团对目标蛋白或分子进行特异内部形成荧光光源，成像时利用较高功率的光源照射样品激发，荧光信号被物镜收集，后经成像系统或投射入眼睛观察或通。显微镜结构与普通的光学显微镜略有不同，需要加入荧光激发光等），二向色分光镜（Dichroic Mirror, DM）及滤光片（Emissi Filter）等组件。荧光激发光源激发样品中的荧光基团发出荧光光分开，滤光片用来筛选激发光和荧光的波长，典型的落射式 1.2（B）所示。荧光显微镜成像技术的出现使得研究细胞内特胞结构成为可能，如细胞膜，细胞骨架，线粒体，高尔基体，。除此之外，利用荧光显微成像技术的高特异性和较高的时空细胞活动的某些动态过程，如胞吞，胞吐，细胞内物质运输，裂凋亡等过程。荧光显微成像技术已成为现代生物学研究必不可

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如图1.3（B）所示。其定义是一个点光源爱里斑光强度的主极大值正好位于另一个爱里斑光强度的第一极小值的位置，此时这个距离就是瑞利分辨率，这个分辨率与光学系统的放大倍数无关。在单色光源的系统中，瑞利分辨率由以下公式描述：rxy=0.61λNA（1.3）rz=λnNA2（1.4）由公式（1.3）和（1.4）可以看出，理论上可以通过提高 NA 的值和降低λ的值来提高光学系统的分辨率。但是在实际中，成像所用光源通常在可见光波段（λ：400nm~700 nm）；受介质折射率和物镜制作工艺的限制，NA 也很难提高（NA 值最高物镜的 NA 值约为 1.7）。这些客观存在限定了传统光学系统的侧向分辨率极限约为 200

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