基于家蚕-杆状病毒表达系统制备重组人蛋白酶3的研究
发布时间：2020-09-21 20:43
蛋白酶3(proteinase 3,PR3)是一种中性丝氨酸蛋白酶,主要储存于中性粒细胞的嗜天青颗粒和特定颗粒以及分泌囊泡中,或者转移到质膜上。PR3能够降解细胞外基质蛋白,杀死微生物,还能影响血小板和内皮细胞的活化,调节多种细胞因子、细胞表面受体的生物活性,参与炎症部位的免疫调节反应,是一种参与多种生理活动的多功能蛋白。近年来,大量研究表明,PR3与多种疾病如血管炎性肉芽肿病(granulomatosis with polyangiitis,GPA)、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)等的发生发展密切相关。抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)是特异性自身抗体,与各种原发性小血管炎相关,且ANCA的滴度与疾病活动一致。作为ANCA的主要靶抗原之一,PR3及其自身抗体(ANCA)在临床诊断、指导治疗以及疾病病理机制研究等方面具有重要的意义。天然人源PR3蛋白是临床上用于相关疾病诊断的最佳选择,但其来源较少,分离纯化过程复杂,质量不均,成本高昂。因此,严重阻碍了相关疾病体外诊断技术的应用,通过重组技术生产人PR3蛋白是比较好的解决方案。目前,虽然已经在大肠杆菌、酵母和昆虫细胞Sf-9等多种细胞系中成功表达了人PR3,但仍存在许多问题,如操作复杂,产量低,重组蛋白抗原性差,成本较高等等,从而无法用来取代天然人源PR3蛋白。本研究尝试利用家蚕杆状病毒表达系统在家蚕幼虫中表达重组人PR3。我们设计表达的人PR3蛋白,其C端含6个组氨酸的His-标签,在N端引入昆虫分泌信号肽Mel;将利用PCR扩增得到的Mel-PR3-His片段连接到供体质粒pFastBac1上,获得重组供体质粒pFastBac1-Mel-PR3-His;以重组供体质粒转染大肠杆菌BmDH10Bac,经Tn7转座元件与家蚕BmNPV杆状病毒穿梭载体Bacmid发生转座,蓝白斑筛选后提取出成功转座的重组Bacmid DNA;将重组Bacmid DNA转染家蚕BmN细胞,从而制备得到重组病毒;以重组病毒感染家蚕幼虫,所表达的重组人PR3经昆虫分泌信号肽介导被释放到血淋巴,收集感染后家蚕幼虫的血淋巴;血淋巴上清通过镍柱再结合两种离子交换柱的综合层析方法进行分离纯化,最终获得重组人PR3蛋白,通过单抗杂交和质谱鉴定进行了验证。本研究通过家蚕-杆状病毒表达系统在五龄家蚕幼虫中成功制备了重组人PR3蛋白,该方法不仅成本低,而且表达量高,便于大规模生产,开辟了利用家蚕幼虫作为生物反应器高效生产具有免疫反应活性重组人PR3蛋白的一条可行的新途径,为相关疾病病理研究及诊断等方面提供了一种探索。
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;Q55
【部分图文】：
2图 1.1 PR3 的序列与三维结构[11]Fig 1.1 Sequence and three-dimensional structure of PR3注：图 A 为人 PR3 蛋白的序列（用糜蛋白酶原编号），催化三联体（His57，Asp102，Ser195）的氨基酸的位置以红色突出显示，糖基化位点（Asn159, Asn113）以蓝色突出显示。图 B 为 PR3 三维结构，PR3 包含两个不对称的 β-桶和 C 末端 -螺旋。N 端和 C 端的柔性环分别以绿色和青色示出。催化三联体 His57、Asp102 和 Ser195 以球-棒表示。图 B 源自文献[11]做了修改。Note: A, the sequence of human PR3 protein. The position of the amino acid of the catalytictriad [(His57, Asp102, Ser195 (using chymotrypsin numbering)] is highlighted in red, and theglycosylation site (Asn159, Asn113) is highlighted in blue. B, PR3 contains two asymmetricβ-barrels and a C-terminal -helix. The flexible loops of the N-terminal and C-terminal β-barrelsare depicted in green and in cyan, respectively. The catalytic triad (His57, Asp102, and Ser195)areshown in a ball-and-stick representation.PR3 与其他糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶如 HNE、CG 一样都具有相似的结构，
图I，为坦)
图 2.1 重组杆状病毒构建的流程示意图Fig 2.1 The Schematic diagram of recombinant baculovirus construction.4.1 PCR 反应计用于 PCR 扩增人 PR3 的引物如下：R3-F：5’-AGGAGACTCGAGATCGTGGGCGGGCACGAGGCG-3’R3-R：5’-TACGGTACCCTAGTGATGGTGATGGTGATGACGGCGCAGCGACG-3’在引物 N 端和 C 端分别引入 Xho I 和 Kpn I 酶切位点（均以双下划线标注时，其C端还引入了编码6个组氨酸的碱基（以单下划线标注）。以PR3的c模板进行 PCR 反应。反应体系如下所示：表 2.10 PCR 反应体系
本文编号：2823970
【学位单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q78;Q55
【部分图文】：
2图 1.1 PR3 的序列与三维结构[11]Fig 1.1 Sequence and three-dimensional structure of PR3注：图 A 为人 PR3 蛋白的序列（用糜蛋白酶原编号），催化三联体（His57，Asp102，Ser195）的氨基酸的位置以红色突出显示，糖基化位点（Asn159, Asn113）以蓝色突出显示。图 B 为 PR3 三维结构，PR3 包含两个不对称的 β-桶和 C 末端 -螺旋。N 端和 C 端的柔性环分别以绿色和青色示出。催化三联体 His57、Asp102 和 Ser195 以球-棒表示。图 B 源自文献[11]做了修改。Note: A, the sequence of human PR3 protein. The position of the amino acid of the catalytictriad [(His57, Asp102, Ser195 (using chymotrypsin numbering)] is highlighted in red, and theglycosylation site (Asn159, Asn113) is highlighted in blue. B, PR3 contains two asymmetricβ-barrels and a C-terminal -helix. The flexible loops of the N-terminal and C-terminal β-barrelsare depicted in green and in cyan, respectively. The catalytic triad (His57, Asp102, and Ser195)areshown in a ball-and-stick representation.PR3 与其他糜蛋白酶样丝氨酸蛋白酶如 HNE、CG 一样都具有相似的结构，
图I，为坦)
图 2.1 重组杆状病毒构建的流程示意图Fig 2.1 The Schematic diagram of recombinant baculovirus construction.4.1 PCR 反应计用于 PCR 扩增人 PR3 的引物如下：R3-F：5’-AGGAGACTCGAGATCGTGGGCGGGCACGAGGCG-3’R3-R：5’-TACGGTACCCTAGTGATGGTGATGGTGATGACGGCGCAGCGACG-3’在引物 N 端和 C 端分别引入 Xho I 和 Kpn I 酶切位点（均以双下划线标注时，其C端还引入了编码6个组氨酸的碱基（以单下划线标注）。以PR3的c模板进行 PCR 反应。反应体系如下所示：表 2.10 PCR 反应体系
【参考文献】
相关期刊论文 前2条
1 张忠信;;ICTV第九次报告对病毒分类系统的一些修改[J];病毒学报;2012年05期
2 韩庆功;崔艳红;刘保国;;昆虫杆状病毒表达系统在禽流感病毒研究中的应用[J];吉林农业科学;2010年01期
本文编号：2823970
本文链接：https://www.wllwen.com/projectlw/swxlw/2823970.html
教材专著
