沙柳SpsLAS2、SpsLAS3基因的克

发布时间：2020-10-14 19:15

　　 分生组织的发育会影响植物的形态建成,而植株形态会极大影响园林植物的群落配置与景观效果。为促进沙柳(Salixpsammophila)的分子定向育种,研究其基因调控机理,本研究利用同源克隆技术克隆获得沙柳SpsLAS2、SpsLAS3基因并做生物信息学及组织特异性表达分析,构建35s::SpsLAS2与35s::SpsLAS3超量表达载体。通过Sitefinding-PCR技术克隆SpsLAS2基因的5'调控区序列片段并做序列分析。具体研究结果如下:1.通过同源克隆技术获得沙柳SpLAS2与SpsLAS3基因的CDS序列,研究发现SpsLAS2和SpsLAS3基因序列相似性达96.69%,氨基酸序列相似性达97.6%。SpsLAS2和SpsLAS3基因ORF长分别为1248、1254 bp,分别编码415和417个氨基酸残基。其氨基酸序列具有 GRS(GIBBERELLIN-INSENSITIVE,REPRESSOR of ga1-3,SCARECROW)基因家族典型的五个结构域[1],属LS亚家族。2.同源蛋白序列比对与系统进化树构建表明,沙柳SpsLAS2、SpsLAS3蛋白序列与欧洲红皮柳亲缘关系最近,其次是毛果杨,而与草本类植物基因差异较大。3.通过对沙柳SpsLAS2、SpsLAS3基因的组织特异性表达结果分析,可知沙柳SpsLAS2基因在叶腋处的表达量最高,然后在韧皮部、成熟叶、茎、根、侧顶芽、顶芽依次降低。沙柳SpsLAS3基因也在叶腋处表达量最高,然后在成熟叶、侧顶芽、顶芽、根、茎、韧皮部依次降低。4.通过酶切产物与35S超量表达载体pMDC32的LR反应构建两基因的超量表达载体,经含Kana的LB培养基筛选、菌落PCR及测序,表明SpsLAS2与SpsLAS3两基因构建超量表达载体成功。5.以沙柳基因组DNA为模板,利用SiteFinding-PCR技术克隆获得了一段长度为501bp的SpsLAS2基因5'调控序列。利用SOGO等在线软件对该序列进行预测与分析发现,该基因5'调控区存在一个可能的启动子,除具有基本的启动子元件CAAT-BOX外,还包含一些典型的光响应元件、激素应答和胁迫诱导相关的顺势作用元件。由此推断SpsLAS2基因的表达可能受光、低温、赤霉素等因素的调控。
【学位单位】：内蒙古农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2;S793.9
【部分图文】：

Ｎ端高度变异，有一定多样性，参与不同信号转换，决定蛋白功能特异性，而??（：端高度保守。０１１八３蛋白一般包含［］１１、乂１￣［１１０、０１１［、？［丫１＾、３八＼￥５个高??度保守的结构域（如图１）［６２］。ＶＨＩＩＤ为蛋白核心结构，在所有ＧＲＡＳ蛋白家族中几??乎都存在。ＬＲＩ和ＬＲＩＩ对称分布于ＶＨＩＩＤ两边，均为约１００个亮氨酸组成的亮氨??酸丰富区。ＬＲＩ包含一个核信号区，具有典型ＲＸ１１（Ｘ１１：?１１个任意氨基酸残基）Ｒ??区。ＬＲｉｒ包含ＬＸＸＬＬ＾Ｓ，［＿］。ＰＦＹＲＥ基序通常含有脯氨酸（Ｐ）、苯丙氨酸（Ｆ）、酪??氨酸（Ｙ）、精氨酸（Ｒ）和谷氨酸（Ｅ）五种氨基酸残Ｓ［６２＿＇ＳＡＷ基序由ＷＸ７Ｇ（Ｘ７：７个??任意氨基酸残基）、Ｌ－Ｗ和ＳＡＷ三个连续部分组成％６５１。??ｖａｒｉａｂｌｅ?ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ??ｉｍｉ?Ｌ?ｒｉｃｈ?Ｉ?Ｌ－ｒｉｃｈ?Ｐ＿Ｅ?ｌ?ＳＡＷ??ＶＨＩＩＤ?ＲＶＥＲ??图１?ＧＡＲＳ蛋白分子结构［６２］??Ｆｉｇ?．１?Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＧＡＲＳ?ｐｒｏｔｅｉｎ［６２］??

Ｂｏｌｌｅ［６６］等对模式植物拟南芥和水稻的基因家族进行进化分析，将Ｇ兄４５??基因家族划分为８个亚家族：Ｌ／ＳＣＸ、別７７、ＳＣｉ３、Ｚ）￡ＸＺ＾、Ｓｄ?＊Ｓ７／ｉ？、ｉ＾和／ＭＭ??（如图２）。他＾＾［６７］等通过进化树分析将０反八３基因家族分为１３个亚家族乂＿７７、??ＡｔＳＣＬ４／７、ＡｔＳＣＬ９、ＡｔＳＨＲ、ＨＡＭ、ＡｔＬＡＳ、ＡｔＳＣＲ、Ａ－ｔＳＣＬ３、ＡｔＳＣＬ２８、ＤＥＬＬＡ、??尸ｄ?ＯＭ和付。其研究结果表明不同植物中基因家族序列存在高度相??似性，这表明该家族在植物中可能是通过串联复制产生重复基因而进行进化的。由??于序列高度保守，同一亚家族成员在功能上也具有相似性或相关性。??—ｒ？纖＂ｄｉｍ念｛５】於??一―—二…?，＾?１?■歲?Ａｔ?????????????．．．．．．－ｐ：：＝ｚ：ｒｒ：??ｒ－———?＆￣ｃｒｒｚ?ｉｔ?ＳＳ??＇?｛?４??ｉ＊獅哪料．：ｐ雄．＊貧??一卿—一？ｎ￡＾ｃｒ＝??ｒ———————屬｜￡??＇１．…—Ｉ?＾?ｊｒＵＩ－－ｃｚｚｚ??ｌ￣ｎ?ｒ??ｔｍ??ｉ＾ｃｚｒ：念雜??Ｍｇ＾ｊＬＪｋ?緣?Ｉ?ｌ…．．－???…＇『一一＜？麵务??－?１?．“、＞？、—??Ｌ．．．．，，，，．．．，．，＾ＷＯａ－＾??－．一一一．．．???一ｒ°—？？＂？＊＊＊?？〇？＃???—?？＾Ｐ１＇??ｆ＿＿纖＾＾娘??ｘｍｕｕ＾一????＾，ｒ－＾Ｃ：?－：：？：?ＳＳ??瞻?Ｌ??ｉ?「￣？Ｍ＝ｎＳｓｉ??—?＊?￣７＝＝ｍ

采用?Ｔｈｅｒｍｏ?Ｆｉｓｈｅｒ?公司生产的?ＧｅｎｅＪＥＴ?Ｐｌａｎｔ?ＲＮＡ?Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ?Ｋｉｔ?试剂盒进行??沙柳总ＲＮＡ的提取。采用紫外分光光度计进行浓度检测，浓度为２７７８?ｎｇ／ｐｌ电泳结??果显示２８?ｓ条带亮度约是１８?ｓ处的两倍（如图３），说明ＲＮＡ提取质量较好。??１??２８ｓ—ｉ，??１８ｓ—??—??图３沙柳总ＲＮＡ电泳图??Ｆｉｇ．３?Ｔｏｔａｌ?ＲＮＡ?ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ?ｏｆ?Ｓａｌｉｘ?ｐｓａｍｍｏｐｈｉｌａ??３．?１．２设计及测试引物结果??提取沙柳全株ＲＮＡ并进行ｃＤＮＡ第一链的合成，以ｃＤＮＡ第一链为模板，利??用所设计的５’端ＵＴＲ区引物与３＇端ＵＴＲ区引物，在２０?｜ｉｌ?Ｐｆｕ高保真酶体系下进行??ＰＣＲ的扩增，得到目标条带，利用Ｔｒａｎｓ２Ｋ?ＤＮＡ?Ｍａｒｋｅｒ进行长度判断，目标条带??为预估约为１５００?ｂｐ左右，实际亮度条带在１０００?ｂｐ与２０００?ｂｐ之间，约为１５００?ｂｐ??符合预估条件（如图４）。??Ｍ?１??２?ｏｏｏｂ?ｐ??滅＿??图４目标基因扩增电泳检测??Ｆｉｇ．?４?Ｅｌｅｃｔｒｏｆｈｏｒｅｓｉｓ?ｐａｔｔｅｒｎ?ｏｆ?ｔａｒｇｅｔ?ｇｅｎｅ??
【参考文献】

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本文编号：2841070