枯草芽孢杆菌glnA和glnR基因的鉴定及其对氨氮的应答

发布时间：2020-10-15 11:13

　　 谷氨酰胺合成酶(Glutamine synthetase,glnA)对铵有很好的吸收作用,能有效降解水质中的部分有害氨氮物质。氮代谢全局转录调控因子(Global nitrogen regulator,glnR)是一类氮源敏感调节因子,可以抑制或激活氮代谢相关基因的表达,从而吸收氮源。本试验用PCR、RT-PCR扩增枯草芽孢杆菌的glnA、glnR基因及并对其进行生物信息学分析,并用实时荧光定量PCR检测glnA、glnR对氨态氮((NH_4)_2SO_4)的应答。对构建的表达载体进行蛋白表达及鉴定,进而初步探究glnA、glnR蛋白功能。获得主要结果如下:本试验克隆出枯草芽孢杆菌glnA基因CDS序列1335 bp,可编码444个氨基酸,glnA蛋白二级结构主要由α螺旋(42.57%),自由卷曲(34.46%)组成。glnA是稳定蛋白,是谷氨酰胺合成酶超家族成员。glnR基因CDS序列408 bp,编码135个氨基酸,glnR蛋白主要由α螺旋(54.07%),自由卷曲(36.30%)组成。glnR为不稳定蛋白,是Mer超家族成员。STRING预测表明:glnA蛋白与nasB、nasD、nasE、glnR等蛋白存在互作关系;glnR蛋白与glnA、amtB、gltA等蛋白存在互作关系。用qRT-PCR检测glnA、glnR基因对氨氮的应答,在24 h时glnA基因在40 mM、50 mM、100 mM和125 mM(NH_4)_2SO_4处理的枯草芽孢杆菌样品中的相对表达量均极显著高于未加(NH_4)_2SO_4的枯草芽孢杆菌对照组样品(p0.01),其中在125 mM相对表达量最高,极显著高于40 mM和100mM(NH_4)_2SO_4处理组(p0.01)。glnR基因在100 mM、125 mM(NH_4)_2SO_4处理枯草芽孢杆菌样品中相对表达量均极显著高于未加(NH_4)_2SO_4的枯草芽孢杆菌对照组(p0.01),其中在125 mM相对表达量最高,极显著高于20 mM、40 mM、50 mM和100 mM处理组(p0.01)。glnA、glnR基因表达量在一定范围内与氨氮浓度的变化呈正相关。SDS-PAGE结果显示glnA蛋白大小约为50 kDa,glnR蛋白大小约14 kDa。质谱鉴定结果显示,glnA蛋白肽段可信度得分最高,为544.1,蛋白质覆盖率为88%,平均分子质量约为50.25 kDa,鉴定为glnA蛋白。glnR蛋白肽段可信度得分最高,为412.12,蛋白质覆盖率为97%,平均分子质量约为14.87 kDa,鉴定为glnR蛋白。对诱导的蛋白进行纯化和复性,并将纯化复性蛋白添加到养殖水质中,glnA蛋白(19μg/mL)在4 h后将水中氨氮含量从0.8 mg/L降解至0.01 mg/L。glnR蛋白(2.72μg/mL)在4 h后将养殖水质氨氮含量从0.8mg/L降解至0.01 mg/L。glnA、glnR蛋白对养殖水质的氨氮含量有较明显的降解作用。毒力试验表明glnA、glnR蛋白表达对大肠杆菌有一定的抑制作用。以上结果表明glnA、glnR基因在氨氮降解中具有一定的作用,这为进一步研究glnA、glnR功能提供科学数据。
【学位单位】：西南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q933
【部分图文】：

GS Ⅱ，GS Ⅲ[12,13]。现有的文献报道 GS Ⅱ菌中主要有 GSⅠ，GSⅢ，[2,12-16]。大多数菌仅有一种 基因编码，原核生物 GS Ⅰ由 12 个相同的约 50 kDa 亚与 glnRA 操纵子紧密相关[18]。调控蛋白（Global nitrogen regulator，glnR）是一类广泛存在革兰氏阳性菌中[19]。glnR 既有 MerR 家族，孢杆菌中的 glnR 蛋白属于 MerR 转录调控家族，M-端翼状的螺旋-转角-螺旋DNA连接结构域和一个C应可利用氮源的变化，glnR 可正向或负向调节氮代谢可以在氮源过剩时抑制 glnRA 操纵子的表达，作为 g]。lnR 的结构

形成的共价键结合起来[2,17]。GS Ⅰ存在 γ-谷氨酰基转移活性，均需要二价金属离子作为辅助因子完成催化反应，如：Mn2+，MlnR 调控因子由 glnR 基因编码， glnR 位于 glnA 上游，是双顺贩子子的一个部分。glnR 调控因子作为 MerR 家族的成员，含有保守的螺旋-转角-螺旋 DNA 结构域和 C-端信号转导结构域[9]，并形成二聚nRA 操纵子的 glnRA01 和 glnRA02 操作子上，在氮源丰富时抑制 gln8]。lnA 和 glnR 的催化机理GS I 型的十二聚体结构露出一些具有重要功能的环，环突出到十二通道中，且是蛋白水解的位点和 ADP 核糖基化位点。图 1-2 显示这色中央通道的新月形脊分子，也是孤立在右边环状结构的亚基上。

枯草芽孢杆菌 glnA 和 glnR 基因的鉴定及其对氨氮的应答析 glnR 基因扩增及克隆基因得到 420 bp 左右条带，条带清晰，与预期片段glnA 基因扩增得到 1350 bp 左右，条带清晰单一，结
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本文编号：2842100