乳酸应激对大肠杆菌O26生物菌膜形成的影响

发布时间：2020-10-18 06:26

　　 食源性致病菌可附着于食品加工器具、设备、食品等表面,可在其上生长,并可进一步形成生物菌膜,造成交叉污染,极大增加了食品安全风险,食源性致病菌生物菌膜是目前食品工业亟待解决的重要难题。近年来,non-0157大肠杆菌尤其是“big six”暴发流行的报道逐渐增多,已成为重要的食源性致病菌之一。目前,关于non-0157大肠杆菌生物菌膜的研究少见报道。Non-0157大肠杆菌与大肠杆菌0157:H7相似,也具有一定的耐酸性,食品加工过程中存在的酸性环境可导致其发生应激响应,不同温度可能影响其应激响应,并进一步影响其生物菌膜的形成。因此,本论文以non-O157大肠杆菌中最主要血清型——026为研究对象,首先对本实验室收集的22株大肠杆菌026进行粘附特性和菌体表面特性分析,进而选取粘附性能不同的菌株探讨不同温度不同乳酸浓度对其生物菌膜形成的影响,进一步采用CLSM和SEM技术揭示其菌膜微观结构的动态变化。本研究将为酸性食品实际生产加工环境中大肠杆菌026风险评估提供理论参考,为进一步研究清除大肠杆菌026生物菌膜有效方法提供科学依据。具体研究内容和结果如下:1、大肠杆菌026不同菌株粘附性能及菌体表面特性分析同时采用微孔板结晶紫染色法和不锈钢片计数法对实验室收集的22株大肠杆菌026进行粘附性能比较,25℃培养72h后,按照测得OD值和培养计数结果对菌株的粘附强弱进行分类。微孔板结晶紫染色法结果表明,22株大肠杆菌026均有粘附性,但存在明显菌株差异(P0.05),其中菌株105H2粘附性最弱,菌株126Z最强。钢片计数法结果显示22株大肠杆菌026均在不锈钢片表面形成了菌膜,但菌膜量存在明显菌株差异(P0.05),但与微孔板结晶紫染色法得出的菌株粘附力强弱不完全一致。采用软琼脂平板评估菌株泳动性,结果显示各菌株泳动性存在差异,swimming 24 h时菌圈直径比较菌株123Z2最大,菌株G13Z2最小,swarming 20 h菌圈直径比较菌株83Z2的最大,菌株57Z1最小。大肠杆菌026表面疏水性和得失电子能力通过其与二甲苯、氯仿和乙酸乙酯溶液的亲和力来评估,结果发现对三种物质的亲和力均存在明显的菌株差异,菌株40Z2疏水性较强,菌株89Z1供电子能力较强,菌株F7Z2得电子能力较强。进一步相关性分析表明,菌体在不锈钢片上的粘附能力与微孔板上的粘附力存在显著正相关性(P0.05),Swimming和Swarming 两种泳动能力之间存在极显著正相关性(P0.01),而泳动性、疏水性与粘附能力之间不存在相关性。2、不同温度乳酸应激下大肠杆菌026生物菌膜形成过程根据上一章试验结果,选取粘附力不同的两株菌株(较强粘附力菌株126Z和较弱粘附力菌株G13Z2)进行生物菌膜形成过程研究。以pH 4.0、5.0乳酸酸化的TSB及正常TSB为培养基质,分别研究15℃和25℃下乳酸对其生物菌膜形成的影响。结果显示,正常TSB中两菌株菌膜形成15℃时均低于25℃时,两种温度下菌株126Z菌膜形成均高于菌株G13Z2。乳酸pH值对大肠杆菌026菌膜形成具有一定抑制作用,培养条件酸性越强,浮游菌数和菌膜形成量越少。温度对026浮游菌数和菌膜形成的影响与乳酸pH值有关,低浓度乳酸时,温度越高浮游菌数和菌膜量增长越快。高浓度乳酸时,15℃下两株菌浮游菌数和菌膜形成受到抑制,后期下降;25℃下两菌株动态变化过程差异明显,菌株126Z后期浮游菌数和菌膜量存在波动,而菌株G13Z2浮游菌数和菌膜形成均显著下降。结果表明,乳酸应激时大肠杆菌026菌膜形成与温度、菌株粘附力相关。3、酸应激对大肠杆菌026生物菌膜微观结构的影响在上述试验基础上,以pH 5.0乳酸酸化的TSB和正常TSB为培养基质,利用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)和扫描电镜(SEM)技术对菌株126Z和菌株G13Z2形成的生物菌膜进行微观结构观察,比较粘附力不同的两株菌1、3、5、7d在两种温度、两种TSB基质中生物菌膜微观结构的动态变化。结果表明,酸应激下大肠杆菌026形成具有一定空间结构的生物菌膜,酸性环境下成膜过程较在中性环境缓慢;粘附力不同的两株菌形成生物菌膜的形态结构受时间、温度和酸度的影响,粘附性较强菌株126Z形成的生物菌膜空间结构更致密。
【学位单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：TS201.3
【部分图文】：

图１．２本课题技术路线图??Ｆｉｇ．?１．２?Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ?ｒｏａｄｍａｐ?ｏｆ?ｔｈｉｓ?ｐｒｏｊｅｃｔ??

Ｎｏｔｅ：?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｌｏｗｅｒｃａｓｅ?ｌｅｔｔｅｒｓ?ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ?（Ｐ?＜?０．０５）．??２．２．３菌体表面泳动能力比较??２２株大肠杆菌０２６的泳动能力见图２．２，通过ｓｗｉｍｍｉｎｇ?８?ｈ、ｓｗｉｍｍｉｎｇ?２０?ｌｉ和??ｓｗａｒｍｉｎｇ?２４?ｈ的菌圈直径大小来评价，图２．３为部分大肠杆菌０２６的泳动性试验平??板照片。由图２．２可知，各菌株间泳动性具有差异，菌株１２３Ｚ２?ｓｗｉｍｍｉｎｇ?２４?ｈ时的??菌圈直径最大，而菌株Ｇ１３Ｚ２?ｓｗｉｍｍｉｎｇ?２４?ｈ时的菌圈直径最小，两个菌株之间??ｓｗｉｍｍｉｎｇ的菌圈大小相差十倍多，菌株１２６Ｚｓｗｉｍｍｉｎｇ８－２４ｈ的阶段增长比较快，??其中，部分菌株具有显著性差异（户＜?〇．〇５）。对于ｓｗａｒｍｉｎｇ?２０?ｈ，２２株菌株之间的??菌圈大小差值远小于ｓｗｉｍｍｉｎｇ，其中菌株８３Ｚ２的ｓｗａｒｍｉｎｇ?２０?ｈ菌圈直径最大，菌??株５７Ｚ１的ｓｗａｒｍｉｎｇ?２０?ｈ菌圈直径最小。??１７??

菌株名称??Ｎａｍｅ?ｏｆ?Ｓｔｒａｉｎｓ??图２．２?２２株大肠杆菌０２６菌体泳动能力（ｎ＝５）??Ｆｉｇ．２．２?Ｍｏｔｉｌｉｔｙ?ｏｆ?２２?ｓｔｒａｉｎｓ?ｏｆ?Ｅ．?ｃｏｌｌ?０２６?（ｎ＝５）??注．？相同指标中，不同小写字母表示具有显著性差异（Ｐ＜〇．〇５）。??Ｎｏｔｅ：?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ?ｌｏｗｅｒｃａｓｅ?ｌｅｔｔｅｒｓ?ｉｎｄｉｃａｔｅ?ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ?ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｓａｍｅ?ｉｎｄｅｘ?（Ｐ?＜?０．０５）．??■■Ｋ３Ｉ??图２．３?—些大肠杆菌０２６菌株泳动性试验平扳图片??Ｆｉｇ．２．３?Ｐｌａｔｅ?ｐｉｃｔｕｒｅｓ?ｏｆ?ｓｏｍｅ?Ｅ．?ｃｏｌｉ?０２６?ｉｓｏｌａｔｅｓ?ｆｏｒ?ｓｗｉｍｍｉｎｇ?ａｎｄ?ｓｗａｍｉｉｎｇ?ｔｅｓｔｓ??２．２．４菌体表面疏水性比较??２２株大肠杆菌０２６的表面疏水性和得失电子能力通过其与二甲苯、氯仿和乙酸??乙酯溶液的亲和力来评估，试验结果见表２．２。??１８??
【参考文献】

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本文编号：2845929