拟南芥ABCG36转运蛋白在木质素生物合成过程中的功能研究

发布时间：2020-10-19 15:55

　　 木质素(Lignin)是自然界含量第二丰富的植物生物聚合物,主要沉积在维管植物的次生细胞壁中,对于营养物质运输、机械支持和植物病原体防御等生理过程至关重要。同时,木质素在工业农业生产上也有着广泛应用。木质素主要由对香豆醇(H型单体,p-coumaryl alcohol)、松柏醇(G型单体,coniferyl alcohol)和芥子醇(S型单体,sinapyl alcohol)三种单体氧化偶联产生,这些单体均通过苯丙烷代谢途径合成,最终通过过氧化物酶和漆酶在细胞壁中聚合。然而,木质素单体合成后,从胞质溶胶运输到细胞壁的机制仍不完全清楚。因此,阐明木质素单体的跨膜转运过程,对于研究木质素生物合成与次生细胞壁调控具有重要意义。经证实,木质素单体(Monolignol)的跨膜转运过程需要利用ATP水解产生的能量,这就暗示了这一过程可能需要ATP结合盒(ABC)转运蛋白的参与。前人已证实,拟南芥中的H型木质素单体由AtABCG29蛋白负责转运。但木质素另外两类重要单体(G和S)如何被转运目前尚不清楚。本研究发现,拟南芥abcg36突变体的根生长明显受到G型和S型木质素单体的抑制,暗示ABCG36蛋白可能参与了G型和S型木质素单体的跨膜转运,为了阐明ABCG36在木质素单体转运中的生物学功能,本论文开展了深入的研究,具体结果如下:1.采用G型和S型木质素单体胁迫处理野生型(WT)拟南芥并进行转录组测序分析,发现AtABCG36转运蛋白基因表达受到显著诱导,暗示该基因可能参与G型和S型木质素单体的转运。从拟南芥中克隆了AtABCG36基因,同时筛选并鉴定获得了T-DNA插入突变体abcg36-1和abcg36-2;2.外源施加G型和S型木质素单体处理拟南芥abcg36-1、abcg36-2突变体,与野生型对照相比,abcg36-1、abcg36-2突变体表现出对G型和S木质素单体更为敏感的表型,植物生长受到抑制,根长更短;3.组织表达谱和原位杂交分析显示,AtABCG36在拟南芥根和茎中表达量较高,而在茎中木质部区域大量积累。亚细胞定位分析证实,AtABCG36蛋白定位在细胞膜上;4.组织切片分析显示,与野生型相比,突变体abcg36-1、abcg36-2中木质部细胞的细胞壁厚度变薄。木质素含量测定发现,突变体abcg36-1、abcg36-2茎中木质素积累显著降低,且木质素单体比例也发生了明显变化。荧光定量检测分析木质素合成途径的相关基因表达水平发现,与野生型相比,abcg36-1、abcg36-2突变体中重要调控因子MYB46、MYB83及关键酶基因CCR1、CAD1和CCoAOMT1等表达水平均不同程度地下调;5.在酵母中表达AtABCG36基因,能够显著增加其对G型和S型木质素单体胁迫的耐受能力。同时,AtABCG36转运蛋白也增强了酵母细胞外排G型和S型木质素单体的能力;6.进一步通过生物信息学分析,克隆了在毛果杨中AtABCG36的同源蛋白PtrABCG36。将PtrABCG36基因在拟南芥中超量表达,与野生型拟南芥相比,转基因植株表现出对G型和S型木质素单体胁迫更强的耐受性,且PtrABCG36超量表达促进了转基因拟南芥茎中木质素的合成。在酵母细胞中,PtrABCG36蛋白同样促进了G型和S型木质素单体外排。综上所述,本研究克隆了拟南芥木质素合成代谢途径上一个重要的转运蛋白基因AtABCG36,遗传和生化实验证明了该基因具有转运G型和S型木质素单体跨膜运输的能力,从而影响了拟南芥茎中木质部的发育。同样地,在木本植物杨树中AtABCG36的同源蛋白PtrABCG36也具有相似的木质素单体转运功能。本研究将有助于阐明植物体内木质素的转运机制,为木材发育调控机制的解析奠定基础。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：Q943.2
【部分图文】：

第 1 章 文献综述1.1 细胞壁细胞壁是植物细胞的重要组成部分，是区别于动物细胞的重要标志之一。活跃生长的细胞被一个薄的初生细胞壁包围，初生细胞壁具有良好的延展性以允许细胞扩张。一旦细胞达到最终的大小和形状，许多细胞就会产生更厚的次生细胞壁。初生细胞壁是所有植物细胞都具有的，而次生细胞壁只能由一些特殊类型的细胞产生，这些细胞通常用于为植株提供机械支撑或用于水及无机盐等营养物质的运输[1]。与初生细胞壁相比，次生细胞壁具有更复杂的内部结构，其中主要成分包括纤维素、半纤维素和木质素，半纤维素成分又包括木聚糖、木栓质、角质层和蜡质层等[2]。某些类型细胞的次生细胞壁，如厚角组织，富含纤维素，几乎不含木质素。然而，大多数次生细胞壁与木质组织有关。木质化细胞壁是木材和草本植物的主要组成部分，是植物生物量的主要来源。木质化次生细胞壁是本文的研究重点。

图 1.2.1 木质素单体及其对应的木质素[5]Figure1.2.1 The lignin monomers and their corresponding lignin.1.2.2 木质素单体的生物合成过程在过去的二十年中，木质素单体生物合成途径得到了广泛的研究，其基本步骤已经被探明[6-8]。木质素的生物合成属于苯丙烷类代谢途径。苯丙烷类代谢途径以苯丙氨酸氨裂合酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）对苯丙氨酸的脱氨基作用为起始步骤。肉桂酸 4-羟化酶（cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）和 4-香豆酯

第 1 章 文献综述桂 酰 转 移 酶 （ p-hydroxycinnamoyl-CoA:shikimate/quinate p-hydroxycinnamoyltransferase HCT）、对香豆酸 3-羟化酶（p-coumarate 3-hydroxylase C3H）、CCR和 CAD 这四种酶则将对香豆酰辅酶 A 转化为 G 型木质素单体。阿魏酸 5-羟化酶（ ferulate 5-hydroxylase F5H ） 、 咖 啡 酸 O- 甲 基 转 移 酶 （ caffeic acidO-methyltransferase COMT）和 CAD 的作用将对香豆酰辅酶 A 转化为 S 型木质素单体。此外，咖啡酰莽草酸酯酶（caffeoyl shikimate esterase，CSE）在最近被报道参与了 G/S 型单体的合成过程，CSE 作用于 C3H 产物咖啡酰莽草酸酯，为咖啡酸辅酶 A 提供替代途径[9]。
【参考文献】

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本文编号：2847418