北极低温反硝化细菌的多样性与脱氮能力分析

发布时间：2020-10-27 05:43

　　 当今经济和社会的迅速发展在大幅改善居民生活质量的同时,也加大了工农业和生活污水的排放量。污水中含有对人体健康有害的物质,对其进行有效处理迫在眉睫。低温条件下,常规污水生物处理技术由于中温微生物自身的机制导致其生长缓慢,影响污水排放的效率,很难达到排放标准。因此,寻找低温条件下的高效反硝化细菌对污水的高效处理与合格排放有着非常重要的作用。利用反硝化筛选培养基对26个站位的北极海洋沉积物进行了反硝化细菌的富集、筛选与分离培养,获得了59株具有16S rRNA基因有效序列的菌株;基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,分离到的菌株分属于3个门、4个纲、8个目、13个科、16个属、23个种,其中γ-变形菌纲(γ-Proteobacteria)的菌株数量所占的比例最大(57.63%);有1株菌(CC2-DN-5)与模式菌株Halocynthiibacter arcticus PAMC 20958的最高序列相似性为96.44%,可能为潜在的新种。理化性质分析结果表明,大部分分离到的菌株能利用阿拉伯糖和葡萄糖等多种碳源生长,并且能产硝酸盐还原酶、α-葡萄糖苷酶和蛋白酶等多种胞外水解酶。代表性菌株的温度和NaCl浓度生长范围的研究结果表明,大部分菌株生长的温度和NaCl浓度的范围为0–30℃和0–6.0%,最适温度为10℃或20℃,最适NaCl浓度为1.5%或4.5%。大多数代表性菌株既能在低温下生长良好,又对NaCl浓度具有广泛的适应能力,表明其对环境的适应性较强,具有良好的应用前景。从3株假单胞菌(Pseudomonas,P13-DN-7、E24-DN-52和C22-DN-54)和1株海杆菌(Marinobacter,P12-DN-1)中克隆到反硝化作用的关键酶亚硝酸还原酶基因(nirS),初步表明其为真正的反硝化细菌。综合考虑菌株对温度、NaCl浓度的耐受性以及反硝化筛选培养基中的生长情况,筛选出生长较好的6株菌(Pseudoalteromonas sp.CC2-DN-6、Paracoccus sp.E24-DN-51、Pseudomonas sp.C22-DN-54、Vibrio sp.CC05-DN-57、Psychrobacter sp.B09-DN-60和Pseudoalteromonas sp.B10-DN-64)研究其在硝化培养基和反硝化培养基中的脱氮性能。研究结果表明,菌株C22-DN-54具有良好的脱氮效果;在硝化试验中,菌株C22-DN-54能在48 h内将NH_4~+-N(初始浓度60 mg/L)的含量降低70%以上;反硝化试验中,该菌株在48 h内对NO_3~?-N(初始浓度40 mg/L)的去除效果几乎为100%。菌株Marinobacter sp.Arc7-DN-1能将NH_4~+或NO_3~?作为唯一氮源在低温条件下生长;可在较宽的温度(0–30℃)和NaCl浓度(1.5–9.0%)范围下生长。菌株Marinobacter sp.Arc7-DN-1的基因组为1条全长4300456 bp(G+C含量,57.64mol%)的环形染色体,包含3811个编码基因、50个tRNA和3个rRNA操纵子(16S-23S-5S rRNA)。KEGG分析结果显示,菌株Marinobacter sp.Arc7-DN-1编码43种与氮代谢相关的蛋白质,包括一条完整的反硝化途径(硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶(NO形成)、NO还原酶和N_2O还原酶)、一条硝酸盐还原途径(硝酸盐还原酶和亚硝酸盐氧化还原酶)以及其他氮代谢相关酶,如硝酸酯单氧酶、谷氨酰胺合成酶等。选取脱氮能力较强的菌株E24-DN-51(Paracoccus sp.)和C22-DN-54(Pseudomonas sp.)构建混合菌群,研究C/N、温度和NaCl浓度对其去除效率的影响。研究结果表明,C/N为1–16时,混合菌群的脱氮性能随着碳氮比的增高而增强。C/N为7–16时,去除效果较好,96 h内对NH_4~+-N和NO_3~?-N的去除率均达到100%,C/N=16时去除效果最好。在5–25℃时,菌群的去除效率随着温度的升高而逐步增大。在10–25℃时,96 h内菌群能完全去除氨氮和硝态氮,COD去除效率也接近100%。在NaCl浓度为0–4.5%时,菌群去除效果较好,NaCl浓度为1.5%时去除效果最好。本研究将为我国低温污水的生物处理提供新的菌种资源,为实践中污水的低温生物处理打下一定的基础。
【学位单位】：青岛科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：X703;X172
【部分图文】：

北极低温反硝化细菌的多样性与脱氮能力分析定菌株多样性；选择代表性菌株进行理化性质测定，以期为筛选出高效菌株应用于低温污水处理提供菌种资源和基础资料。2.2 材料与方法2.2.1 样品来源与培养基本实验所用的样品是 2016 年 7–9 月由中国第七次科学考察队采集的北极海洋沉积物，样品采集站位分布图如图 2-1 所示，共有 26 个站位，置于 4 ℃保存。

、R11、R20 和 P23 这 7 个站位均只分离得到菌株 1 株。不同的站位分离硝化的数量有所差异，说明站位所在的经纬度和水的深度可能会对菌株况造成影响。不同站位的海洋沉积物样品中微生物的数量因环境的不同异，说明了微生物具有多样性。根据菌株的 16S rRNA 基因序列，在 NCBI 与相似性最高的模式菌株ST 比对分析（详见附录）。分析结果显示，58 株菌株与模式菌株 16S 的序列最高相似性超过 97%，相似性低于 97%的菌株只有 1 株（CC2-DN为潜在的新种。根据 16S rRNA 分子鉴定结果得出，59 株菌分属于变形roteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes），；分属于 -变形菌纲（ -Proteobacteria）、 -变形菌纲（ -Proteobacter菌纲（Actinobacteria_c）和芽孢杆菌纲（Bacilli），共 4 个纲；属于 （ -Proteobacteria）的菌株的数量最多，为 34 株，占分离菌株总数的 57.6 -变形菌纲（ -Proteobacteria）、放线菌纲（Actinobacteria_c）的菌株 15 和 9，分别占菌株总数的 25.42%和 15.25%。仅有一株菌属于芽孢杆acilli），占菌株总数的 1.7%（图 2-2）。

16括号（）中数字代表归属于该种的菌株数The number in bracket represents the number of strains belonging to the species图 2-3 北极海洋沉积物中反硝化细菌的系统发育树Fig. 2-3 Neighbor–Joining tree showing the phylogenetic relationship of denitrifying bacteriaisolated from Arctic Ocean sediments2.3.3 理化性质分析（1）菌株的 API 20 NE 分析结果用非苛养非肠道革兰氏阴性杆菌鉴定试剂盒API NE20对19株代表性种属的菌株进行了生理生化指标测定（表 2-3 和图 2-4）。结果表明，这些菌株具有利用各种碳源生长的能力，并且可以产各种胞外水解酶。对硝酸盐具有还原作用的菌
【参考文献】

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本文编号：2858126